牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV )gB基因序列 ,应用 0ligo4.1程序设计一对引物PB1/PB2 ,分别对IBRVLA株、洛精、美精、BarthaNu/ 67株、B7株、云南 -1和云南 -2分离株进行了PCR扩增。结果显示 7株IBR病毒DNA均有 3 3 9bp的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒 (PRV)、马立克氏病毒 (MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV)进行扩增 ,均未见特异性条带 ,证明该引物是特异的 ;检测PCR的敏感性表明 ,该法可检测出 3 pg的病毒DNA。

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因PCR诊断方法的建立

为寻求一种快速灵敏的环形泰勒虫病PCR检测方法,基于环形泰勒虫裂殖体表面蛋白(Theirelia annulata surface protein,TaSP)基因序列保守区设计特异性引物,通过PCR技术扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段。用该引物对环形泰勒虫、中华泰勒虫、瑟式泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫基因组模板进行特异性试验,对环形泰勒虫基因组模板进行梯度稀释后扩增,以确定试验的敏感性,同时用本试验建立的方法与常规显微镜镜检方法对150份血清样品进行检测。特异性试验结果显示,在被检测的9个样本中,只有环形泰勒虫基因组模板中扩增出了符合大小的特异核苷酸片段;敏感性试验结果表明,PCR对环形泰勒虫的扩增效率可达到10-10;通过对150份血清样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异性强、敏感度高等特点,适用于牛环形泰勒虫病的检测。

养殖对虾病毒病PCR诊断方法的建立及在流行病学调查中的应用

利用分子生物学技术 ,建立了一种快速、准确、实用的养殖对虾白斑病和斑节对虾杆状病毒的 PCR检测方法 ,通过特异性试验和敏感性试验 ,并经测序 ,其 PCR产物与目的基因符合率为 99% ,证实该方法具有良好的特异性。本项目还将该方法应用于对虾育苗过程的各个环节 ,并对珠海地区养殖场养殖对虾、市场销售的对虾和进出口对虾等进行了对虾白斑病毒和斑节对虾杆状病毒的流行病学调查。在调查中首次发现虾蛄对虾白斑病毒呈阳性反应 ,说明该病毒可以感染除对虾外的节肢动物。

伊犁地区绵羊李氏杆菌病PCR诊断方法的建立

对伊犁部分地区绵羊血液、鼻拭、肛拭、青贮、水源进行检测,共抽检样本280个,经对样本中的细菌分离、纯化,并针对李氏杆菌高度保守的Hly基因设计特异性引物进行PCR扩增,对扩增产物进行分析。结果表明:有5株分离株含有约743 bp大小的李氏杆菌所特有的扩增片段,诊断为李氏杆菌。

关于猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立

利用PCR检测方法对猪疑似附红细胞体病进行检测。通过无菌采取病猪的全血,提取基因组DNA,设计特异性引物,进行PCR扩增16S rRNA,所得基因序列进行序列测定。PCR可扩增出700 bp左右的条带,与预期结果相一致。进而建立一种简单、安全、敏感、准确性高的猪附红细胞体病PCR检测方法。

猪流感病毒三联PCR诊断方法的建立

猪流感是由正黏病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病,而且在临床实践中,普遍存在猪流感病毒与猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)混合感染的现象。为建立猪流感的快速诊断方法,本文针对病毒保守区的基因序列,设计3对特异性引物用于扩增SIV。

驽巴贝斯虫病PCR检测方法的建立和应用

根据驽巴贝斯虫(Babesia caballi)18S rRNA基因序列设计1对特异性引物,扩增出452 bp核苷酸片段,建立了检测驽巴贝斯虫病的PCR方法。敏感性试验结果表明,该方法最低能检出0.01 fg/μL驽巴贝斯虫DNA模板。特异性试验结果显示,在被检测的6个巴贝斯虫株中,仅驽巴贝斯虫株能扩增出特异性片段,马泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫的扩增结果均为阴性。对45份马属动物血样进行检测,本研究建立的PCR方法测得驽巴贝斯虫病的阳性率为26.67%(12/45),与显微镜检测方法进行了比较,结果显示PCR检测方法可显著提高驽巴贝斯虫的检出率。

马泰勒虫病PCR检测方法的建立和应用

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫(Theileria equi,T.equi)PCR检测方法。基于马泰勒虫18SrRNA基因序列,在其V4高变区设计特异性引物Te-18F、Te-18R,通过PCR技术获得了531bp的核酸片段。用该引物对马泰勒虫、马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合样本、驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫基因组模板进行特异性试验。同时对马泰勒虫基因组模板进行不同浓度稀释后扩增,以便于确定试验的敏感性。用本试验建立的方法与常规显微镜镜检方法对45份马属动物血样进行检测。特异性试验显示,在被检测的9个样本中,只有马泰勒虫及马泰勒虫和驽巴贝斯虫混合模板中扩增出了符合大小的特异核酸片段。驽巴贝斯虫、尤氏泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和瑟氏泰勒虫的扩增结果均为阴性。灵敏度试验结果表明,PCR对马泰勒虫的扩增效率可达到10-13。对本试验建立的PCR检测马泰勒虫方法评估结果显示,PCR对马泰勒虫的检出率为17.78%(8/45),显微镜镜检结果只有8.89%(4/45)两者的符合率为100%。本试验建立的马泰勒虫PCR检测方法不失,为一种好的检测方法。