羊毛及羊绒制品实时荧光PCR鉴定方法研究

羊毛及羊绒制品是我国重要的纺织产品。市面上以次充好的掺假现象时常发生,建立客观、稳定、快速、准确的鉴别方法是当前的迫切之需。本文采用分子生物学手段对羊毛及羊绒制品进行鉴定,开发了适用于羊毛及羊绒制品的DNA提取方法,并建立了荧光PCR检测体系,同时进行方法特异性、检出限分析,结果表明本方法特异性好,检出限为10ngDNA(含担体DNA)。采用建立的方法体系对16个样品进行检测,结果表明本方法与传统鉴定方法具有一致性,灵敏度比传统方法更优,具有应用于羊毛及羊绒制品日常检测的可行性。

干肉制品中霉菌PCR鉴定方法的建立

为了早期预防传统牛肉干发生霉变,建立了牛肉干中真菌PCR的鉴定方法,在特异性和敏感性方面对所建立的PCR方法进行了验证。其中特异性试验以霉变的鲜牛肉、酵母菌、乳酸球菌、乳酸杆菌、大肠杆菌为材料进行验证;敏感性试验以霉变的鲜牛肉为材料,提取其DNA并将其稀释成不同的浓度进行PCR验证。结果显示:特异性试验中仅霉菌样品在约300 bp处出现特异性条带,而其他样品在该处无特异性条带出现,表明具有良好的特异性;敏感性试验中,霉菌DNA原液、10倍稀释、100倍稀释、1 000倍稀释时均出现了约300 bp的特异性条带,即霉菌DNA模板稀释度为1 000倍(2 ng/μL)时仍对引物有敏感性。该试验为市场传统牛肉干真菌PCR检测工作提供了依据。

NewLeaf-Y^(TM)转基因马铃薯PCR检测鉴定方法的建立

建立了商业化种植的NewLeaf-YTM转基因马铃薯的筛选检测和鉴定的PCR方法。该方法根据马铃薯自身patatin基因作为内源特异参照基因扩增216bp片段,检查模板DNA提取的质量,避免了假阴性结果;同时扩增FMV35S启动子基因225bp片段和PVY-cp基因161bp片段。PCR反应循环参数是94℃2min;94℃40s,55℃60s,72℃60s,35次循环;之后72℃延伸5min。本实验中的F-primer(PVY01-5')/R-primer(PVY01-3')引物是针对商业化种植的NewLeaf-YTM转基因马铃薯PVY-cp抗病毒基因而设计的,具有很强的特异性,可以达到对NewLeaf-YTM转基因马铃薯鉴定的目的。

农杆菌介导转化莱茵衣藻体系的优化

为建立根癌农杆菌介导的莱茵衣藻快速简便高效的遗传转化体系,本研究以模式生物莱茵衣藻为受体材料,从转化方法和转化子快速鉴定两个方面进行了优化。[方法]比较了固体培养基共培养转化方法和液体培养基共培养转化方法对根癌农杆菌LBA 4404介导的莱茵衣藻CC425转化效率的影响;研究并比较了(1)首先经过TE裂解再进行PCR(两步法)和(2)不经TE裂解直接进行PCR(一步法)的两种转化子鉴定方法的最佳反应条件和扩增效率。[结果]农杆菌LBA 4404和莱茵衣藻CC425液体培养基共培养5 d后的转化效果最好,转化率达43.33±1.67个转化子/10^(6)个藻细胞。PCR最佳反应条件为:使用高保真DNA聚合酶Taq 1进行扩增;参加PCR反应的细胞密度为5×10^(3)-5×10^(6)个/mL;TE裂解缓冲液沸水浴20 min(两步直接PCR方法),或者预变性15 min(一步直接PCR方法)。两步法直接PCR的扩增效率优于一步法,但后者反应步骤更简洁。[结论]本研究建立并优化了农杆菌液体介导莱茵衣藻遗传转化体系,该体系可快速获得遗传转化子,减少转化工作量。