应用PCR-反向点杂交法检测β-地中海贫血基因点突变

目的对疑似β-地中海贫血的4例患者进行基因诊断。方法针对β-珠蛋白基因上17个位点突变,使用特异性带有生物素标记的引物进行PCR扩增,扩增产物与固定在膜条上的寡核苷酸探针进行杂交,并通过一系列显色反应,明确检测样品在17个位点是否发生了突变,以及是否为突变纯合子或杂合子。结果 1号和2号患者均为CD17M(A→T)/N,βEM(GAG→AAG)/N双重杂合子;D3号患者为IVS-Ⅱ-654M(C→T)/N杂合子;D4号患者为IVS-Ⅱ-654M/IVS-Ⅱ-654M(C→T)纯合子。结论利用PCR-反向点杂交法技术,能对β-地中海贫血患者进行基因诊断,对其产前诊断、临床治疗以及携带者检出具有重要意义。

PCR-反向点杂交法在外阴阴道念珠菌病诊断及白念珠菌耐药基因突变检测中的应用

目的评价PCR-反向点杂交法用于念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的应用价值。方法收集念珠菌性阴道炎患者及体检健康妇女分泌物各285份和50份。用生物梅里埃酵母菌鉴定卡进行菌种鉴定,用最低抑菌浓度(MIC)法(郑州安图真菌快速培养鉴定药敏试剂)进行药敏试验;采用PCR-反向点杂交法(深圳亚能念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测试剂)进行菌种鉴定和耐药基因突变检测;采用PCR及测序方法进行耐药基因的检测。分别以培养鉴定法、MIC法、核酸序列测定法为对比方法,评价PCR-反向点杂交法念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的敏感性、特异性及准确性。结果与培养鉴定法相比,PCR-反向点杂交法检测6种念珠菌菌种的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为95%、96%、96%、98%、97%以上,2种方法检测6种念珠菌(白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和季也蒙念珠菌)结果的差异无统计学意义(χ~2值分别为0.44、0、0、0、0和0,P均>0.05),一致性较好(Kappa均>0.9)。与MIC法相比,PCR-反向点杂交法检测白念珠菌耐药的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为98%、88%、98%、88%和96%,2种方法检测结果的差异无统计学意义(χ~2=0.17,P>0.05),一致性较好(Kappa>0.8)。PCR-反向点杂交法与核酸序列测定法相比,对6种白念珠菌耐药基因突变位点的检测结果完全一致。结论PCR-反向点杂交法在念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测上与培养鉴定法以及核酸序列测定法的一致性高,比传统检测方法更早期更快速,可应用于外阴阴道念珠菌病(VVC)的辅助诊断。

PCR-反向点杂交法检测乙型肝炎病毒的基因耐药变异与基因分型

目的探讨PCR-反向点杂交法用于检测HBV基因耐药变异与基因分型的可行性。方法采用PCR-反向点杂交法对89例慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因耐药变异和基因分型检测;用DNA测序法对患者的HBV DNA进行测序,确定HBV的耐药变异与基因分型情况,评价PCR-反向点杂交法的准确性、灵敏度及临床应用价值。结果 89例标本经PCR-反向点杂交法检出变异株31例,其中rtL180M+rtM204V联合突变株15例,rtN236T突变株4例,rtM204I突变株9例,rtA181V突变株3例;野生株55例,阴性标本3例;HBV基因型中C基因型72例,B基因型14例。经测序确定PCR-反向点杂交法检测准确度、特异度均为100%。结论采用PCR-反向点杂交法检测HBV基因耐药变异与基因分型可靠、简便、经济、高效,适宜临床推广。

PCR-反向点杂交法在HPV分型中的临床应用

分析HPV分型中应用PCR-反向点杂交法的实际效果。方法 将本院2020年8月至2022年11月2940例应用PCR-反向点杂交法检测HPV分型的门诊、住院患者作为研究对象,对数据进行统计,分析HPV分型分布情况。结果 2940例女性经PCR-反向点杂交法检出HPV阳性501例(检出率:17.04%)、HPV单型阳性377例(检出率:12.82%)、HPV2型以上阳性124例(检出率(4.22%)、纯低危型阳性54例(检出率1.84%)、高危型阳性447例(检出率:12.50%)、高危型在HPV阳性中占比89.22%;HPV高危型阳性分布情况中以HPV-52(141/2940,4.80%)、HPV-51(58/2940,1.97%)、HPV-53(56/2940,1.90%)、HPV-16(54/2940,1.83%)、HPV-58(50/2940,1.70%)阳性率相对较高;2940例女性中HPV阳性占比最高的是31-40岁年龄段(占比率达34.33%),21-50岁是HPV阳性的高危人群,总共占比率高达79.24%。结论 通过HPV分型检测,可确定HPV感染的型别、区分单一感染与多重感染、区分持续感染与一过性感染患,对于预防宫颈癌变、提高预后效果有重要意义;PCR-反向点杂交法在确定HPV分型中具有极高的应用价值,可依据受检者感染的基因类别,明确受检者感染风险,进行进一步检查、复查,对持续高危型感染者进行早期治疗,在预防宫颈癌中具有积极意义。

应用PCR-反向斑点杂交法快速检测和鉴定医学重要真菌

目的 建立一种以PCR为基础的的检测和鉴定医学重要真菌的方法。方法 将白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、都柏林念珠菌和新型隐球菌的种特异性探针加尾后固定于硝酸纤维素膜上 ;用标记生物素的真菌通用引物扩增经提取的各真菌DNA ,与固定在膜上的探针杂交。结果 所用的真菌通用引物可扩增12种临床常见的真菌DNA ,扩增片段长度在 35 0bp左右。 8种特异性探针分别与上述真菌PCR扩增产物杂交 ,结果表明 8种探针具有高度的特异性。通过 39例临床标本和 2 5例临床分离菌株的检测 ,PCR -反向杂交法与真菌培养法的结果基本一致 ,且鉴定时间也由传统培养鉴定方法约需 1周的时间缩短至 2天。结论 该方法可快速、正确地将 8种临床常见真菌鉴定到种水平 ,如经大量临床标本的检测验证 ,可望在临床微生物实验室开展。

用PCR-反向点杂交法检测九江地区乙型肝炎病毒基因型

目的调查九江地区乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)基因型的分布情况。方法采用PCR-反向点杂交法,对203例HBV DNA阳性患者HBV进行基因型分析。结果共检测了203例患者,成功分型199例,占98.03%。其中B型160例,占78.82%;C型24例,占11.82%;B、C混合型14例,占6.90%;D型1例,占0.49%。结论利用PCR-反向点杂交法技术可以较简便地对HBV进行基因型分析,分型成功率高,适用于临床检测;在九江地区人群中感染的HBV以B型为主,C型次之,其它型别极少见。

FFPE组织HPV检测中PCR-反向点杂交技术的应用:两种核酸提取方法的比较

目的比较两种不同核酸提取方法在人乳头瘤病毒(HPV)亚型检测中的应用,为实验室选择相应的核酸提取方法来获得有效的HPV结果提供依据。方法收集25例浸润性宫颈癌福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织标本,采用粗提法和纯化法两种核酸提取方法提取DNA标本,并通过检测DNA浓度、纯度及内参β-Globin来评估DNA质量。将提取的DNA经PCR扩增后,应用PCR-反向点杂交法检测HPV亚型,分析两种提取方法HPV检测结果的有效性及一致性。结果两种提取方法均能获得适量的DNA用于HPV检测,粗提法较纯化法可获得较高的DNA浓度(P<0.05),但存有一定有机物及蛋白质污染。纯化法较粗提法获得的DNA纯度更高(P<0.05)。将粗提法和纯化法提取的DNA用于检测HPV感染,总HPV阳性率分别为92%和96%。采用粗提法提取的DNA标本高危型HPV(HR-HPV)阳性率低于纯化法(92%vs.96%),但单一型HPV16阳性率高于纯化法(44%vs.36%);与纯化法相比,粗提法提取的DNA无法检测出更多型别的混合感染,而FFPE组织标本经纯化法分离后可检测出HPV33、HPV53、HPV58等多型别感染。结论采用粗提法和纯化法进行FFPE组织核酸提取,均可获得足量DNA用于HPV亚型检测,且HR-HPV阳性率达90%以上。粗提法具有操作简便、耗时较短、成本较低等优势,能够获得有效的HPV结果,但对于HPV多型别感染的检测表现欠佳。

PCR-反向点杂交法检测凉山州乙型肝炎病毒基因型

目的调查凉山州乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因型的分布情况。方法采用PCR-反向点杂交法(polymerase chain reaction-reverse dot blot,PCR-RDB)对44例HBV DNA阳性患者HBV进行基因型分析,并选取6例健康人作为对照。结果共检测了44例患者,成功分型38例,占86.36%,其中B型23例,占52.27%,C型13例,占29.55%,B、C混合型1例,占2.27%,未知型7例,占15.91%。结论利用PCR-RDB可以简便地对HBV进行基因型分析,分型成功率较高,适用于临床检测。在凉山州乙型肝炎人群中感染的HBV以B型为主,C型次之,其他型别极少见。

多重PCR/反向线点杂交(RLB)检测细菌性脑膜炎病原体的研究

目的建立快速、高通量的多重PCR/反向线点杂交(RLB)的方法检测3种细菌性脑膜炎病原体--肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌。方法针对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌的特异性基因序列设计引物和相应的特异性探针,优化多重PCR/RLB检测中的引物浓度、dNTP浓度、探针的浓度等的条件。结果多重PCR/RLB检测对肺炎链球菌DNA最低检测极限可达6.2×10-1ng/μl,对流感嗜血杆菌DNA最低检测极限可达8.5×10-8ng/μl,对脑膜炎奈瑟菌DNA最低检测极限可达8.3×10-8ng/μl。结论多重PCR/RLB检测体系能够正确的鉴定3种细菌性脑膜炎病原体,用于临床样本的高通量筛查细菌性脑膜炎病原体,特异性好,灵敏度高。

基于PCR-反向点杂交法对江西地区分枝杆菌感染状况分析

目的了解江西地区分枝杆菌感染流行现状,为临床防治提供科学依据。方法运用PCR-反向点杂交法对345例可疑分枝杆菌感染患者不同标本进行分枝杆菌核酸检测。结果 345份标本中共检出68例阳性(阳性率为19.7%),其中结核分枝杆菌复合群(MTC)59例(占86.76%),非结核分枝杆菌(NTM)8例(占11.77%),混合感染(MTC/MIN)1例(1.47%);NTM感染中检测出5种,分别为偶发/猪分枝杆菌(MFO)、戈登分枝杆菌(MGO)、胞内分枝杆菌(MIN)、龟分枝杆菌脓肿亚肿(MAB)、蟾蜍分枝杆菌(MXE),其中以MIN为主,占5.88%;不同标本中分枝杆菌检出率不同,痰液、灌洗液、分泌物、胸水中分枝杆菌检出率分别为:31.5%、20.3%、16.0%、4.7%。结论江西地区分枝杆菌感染主要以MTC为主,且多为单一感染。

PCR荧光法与PCR-反向点杂交法检验人乳头瘤病毒对比分析

目的将PCR荧光法和PCR-反向点杂交法用于人乳头瘤病毒检验中,分析其检验结果。方法2014年4月~2017年4月本院收治的100例宫颈炎或是疑似人乳头瘤病毒感染的患者归入笔者研究目标,对100例患者都进行CR荧光法检验和PCR-反向点杂交法检验,统计2种不同检验方法的阳性检出合计值及两者检验结果的符合总计值。结果 PCR-反向点杂交法检验的人乳头瘤病毒阳性检出合计值与PCR荧光法检验对比,差异有统计学意义(P<0.05),PCR荧光法检验结果和PCR-反向点杂交法检验结果对比,阴性符合总计值、阳性符合总计值、总符合总计值分别是70.00%、93.02%、94.00%。结论 PCR荧光法和PCR-反向点杂交法用于人乳头瘤病毒检验都具有良好效果,且PCR-反向点杂交法检验的阳性检出率更高一些。

人乳头瘤病毒反向点杂交检测方法的研究

目的 通过检测正常孕妇及胎儿HPV的感染情况 ,探索建立一种简便、有效的HPV检测方法。方法 在以GP5+ / 6+ 为引物的人乳头瘤病毒检测方法的基础上 ,利用生物素标记引物 (bio -GPbt) ,进行GP -PCR ,并用此PCR产物与特异性内寡核苷酸探针 (SIOP)进行反向点杂交 (RDBH) ,从而达到检测HPV感染并对其分型的目的。结果 1 .在对 1 1 9份样品的检测中 ,普通 2 %琼脂糖电泳的阳性率为 30 3 %(36/ 1 1 9) ,而反向点杂交的阳性率为 43 7%(52 / 1 1 9) ,两者之间差别有显著性 (χ2 =4 0 568,0 0 1 <P <0 0 5) ,说明反向点杂交 (RDBH)在HPV的检测中有较高的敏感性 ;2 .在用于检测的 4个HPV探针 (6B、1 1、1 6、1 8)之间 ,未发现非特异性的杂交 ,说明反向点杂交 (RDBH)

Gap-LCR-ELISA法与PCR-反向杂交法对沙眼衣原体检测的对比研究

目的比较质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附试验测定(Gap-LCR-ELISA)法及聚合酶链式反应(PCR)-反向杂交法对沙眼衣原体(CT)的检测效果。方法对我院眼科送检临床标本167份进行CT检测,其中采用Gap-LCR-ELISA法检测80份,采用PCR-反向杂交法检测87份。并对2种方法检出阳性率及其敏感度与特异度进行比较。结果Gap-LCR-ELISA法检出阳性率为26.2%,PCR-反向杂交法检出率为34.5%,差异无统计学意义(P>0.05);两法的敏感度和特异度均为100.0%和98.0%。结论Gap-LCR-ELISA法和PCR-反向杂交法均可作为CT的检测方法,值得临床推广应用。

PCR荧光法与PCR-反向斑点杂交法检验人乳头瘤病毒比较观察

目的观察比较PCR-反向斑点杂交法(PCR-RDB)与PCR荧光法在HPV(人乳头瘤病毒)中的检验效果。方法选择我院2011年1月至2014年1月收集的女性宫颈脱落细胞样本共251例,分别行PCR-RDB检测和PCR荧光法对HPV进行检测,比较两种方法检测结果。另将两种方法检测8种HPV结果均显示为阳性的患者设为观察组,其余患者设为对照组,病理检测作判定标准,比较组间阳性率。结果 PCR荧光法检测阳性率为36.65%(92/251);PCR荧光法检测阳性率为40.24%(101/251);两种方法检测8种高危HPV一致率为79.68%(200/251),观察组行TCT检测和组织病理活检结果 ,病变率为42.31%(22/52)。对照组病变率为10.77%(14/130)。两者相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PCR-RDB检测和PCR荧光法在HPV检测中具有较好的一致性,采用高危型HPV检测能有效筛查宫颈癌。

反向点杂交法和荧光PCR法检测人乳头瘤病毒DNA阳性符合率分析

目的分析反向点杂交法和荧光PCR法检测人乳头瘤病毒DNA阳性符合率。方法将496例宫颈刷标本分别用反向点杂交法与荧光法检测人乳头瘤病毒DNA。结果人乳头瘤病毒DNA阳性率反向点杂交法为28.83%(143/496),荧光PCR法为29.44%(146/496),2种检测方法差异无统计学意义(P>0.05)。反向点杂交法与荧光法检测人乳头瘤病毒DNA有475例标本检测结果一致,其中阳性符合率为46.37%(134/289),阴性符合率为48.51%(341/703),总符合率为95.77%(475/496),两者间的一致性较好(Kappa=0.897)。结论反向点杂交与荧光PCR2种检测方法的检测阳性符合率一致性良好。

反向点杂交技术联合血常规检测对β-地贫基因的诊断价值

目的研究反向点杂交(RDB)技术联合血常规检测对β-地贫基因的诊断价值。方法选取2021年1月-2023年3月我院收治的60例β-地中海贫血患者为研究组,并选取同期在我院体检的健康人群60名为对照组,均进行血常规和RDB技术检测。比较两组人群血常规指标[红细胞分布宽度(RDW)、红细胞体积(MCV)、红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞血红蛋白量(MCH)],ROC曲线分析不同检查方法(血常规、RDB、血常规+RDB)诊断β-地贫基因的效能。结果研究组RDW大于对照组,MCV、MCHC、MCH低于对照组(P<0.05);ROC曲线显示,血常规+RDB检查对β-地贫基因检出率为97.86%,高于血常规、RDB单独检测(P<0.05),而血常规与RDB检测对β-地贫基因检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论RDB技术联合血常规检测可提高对β-地贫基因的诊断价值,一定程度减小漏诊、误诊情况,为临床诊治β-地中海贫血提供更可靠的参考,可作为临床筛查诊断β-地贫基因的首选方法。

实时PCR和PCR-RDB法检测人乳头瘤病毒的比对研究

目的：比较实时 PCR 法和 PCR-反向点杂交法（PCR-RDB）检测 HPV 的一致性。方法收集109份女性生殖道样本，利用实时 PCR 法和 PCR-RDB 法分别检测 HPV 感染和基因型分布情况，不一致样本采用 PCR-悬浮芯片杂交法复检。结果83.5％（91／109）的样本两种方法结果一致（kappa＝0.671），18例不一致样本 PCR-悬浮芯片杂交法复检显示7例与实时 PCR相符，11例与 PCR-RDB 相符；高、低病毒载量组间 PCR-RDB 法的检测结果差异无统计学意义（χ2＝1.476，P ＝0.224）。结论实时 PCR 和 PCR-RDB 两法用于 HPV 检测一致性一般；HPV 病毒载量在103～108范围内时 PCR-RDB 法的阳性率较稳定。

BALF Xpert MTB/RIF和PCR-反向斑点杂交技术在涂阴肺结核诊断中的价值

目的:对比支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)结核分枝杆菌(MTB)/利福平(RIF)耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)和聚合酶链反应(PCR)-反向斑点杂交技术在涂阴肺结核诊断中的价值。方法:纳入2021年6月—2023年1月于江西省胸科医院接受治疗的肺结核患者共200例,所有患者均留取BALF送检,进行Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑点杂交技术检测。以病理检查结果为金标准,统计确诊涂阴肺结核的占比情况,并计算Xpert MTB/RIF与PCR-反向斑点杂交技术两种检测方法的阳性率、与金标准结果的一致性,并评估两种检测方法对涂阴肺结核的诊断价值。结果:Xpert MTB/RIF检测涂阴肺结核的阳性率(76.50%)与PCR-反向斑点杂交技术(69.50%)比较,差异无统计学意义(χ^(2)=2.486,P=0.115)。200例肺结核患者中确诊为涂阴肺结核有137例,占比68.50%;Xpert MTB/RIF的符合率(94.89%)高于PCR-反向斑点杂交技术(74.45%),差异有统计学意义(P<0.05)。Xpert MTB/RIF诊断涂阴肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度均高于PCR-反向斑点杂交技术(P<0.05)。结论:Xpert MTB/RIF、PCR-反向斑点杂交技术均可用于涂阴肺结核诊断中,其中Xpert MTB/RIF的诊断价值更高,可辅助临床早期诊断筛查。

实时荧光PCR检验在高危HPV检测中的应用价值分析

基于临床比对的方式,评估实时荧光PCR检测法在高危HPV检测中的应用价值。方法 从2021年7月~2022年7月前来本院进行高危HPV检测的受检中选取100例,均接受PCR-反向点杂交检测及实时荧光PCR检测,首先比对两种检测结果与病理检测金标准结果是否接近,之后比较两种检查方法对100例受检者的宫颈慢性炎症、宫颈上皮内瘤病变、宫颈癌三种宫颈相关病变的高危性HPV阳性检出率。结果 ①PCR-反向点杂交法对100例受检者高危HPV检出阳性率达到68.00%,实时荧光PCR检测方法的检出率为83.00%,病理检测金标准结果为90.00%。将PCR-反向点杂交法、实时荧光PCR检测法检测结果与病理检测金标准结果进行分别比对的结果是:PCR-反向点杂交法与病理金标准的卡方检验值为14.587,P值<0.001;实时荧光PCR检测法与病理金标准的卡方检验值为2.098,P>0.05。②PCR-反向点杂交法检出宫颈相关病变高危性HPV阳性率为45.00%,低于实时荧光PCR的67.00%的检出率,P<0.05。结论 实时荧光PCR检测结果与病理检测金标准更加接近,差异不具有统计学差异性,PCR-反向点杂交检测结果与病理金标准差距较大,故实时荧光PCR检测结果更加准确。此外,实时荧光PCR检测在宫颈相关病变高危性HPV阳性方面的检出率更高。

HPV分型检测技术的质量管理与控制:基于PCR-RDB平台

聚合酶链反应-反向点杂交法(PCR-RDB)是一种采用PCR体外扩增与DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术,对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要意义。而该平台的质量管理和控制是保证人乳头瘤病毒(HPV)分型检测结果准确可靠的前提。本文通过结合作者PCR实验室工作体会就PCR实验室质量管理与控制等方面进行介绍,从而提高PCR实验室及PCR-RDB平台操作流程的规范化管理和标准化的建设。