PCR-微孔板反向杂交法在结核分枝杆菌检测中的应用

目的 评价PCR 微孔板反向杂交法检测临床标本中结核分枝杆菌 (MTB)的应用价值。方法 应用集菌涂片镜检法、培养法、PCR法、PCR 微孔板反向杂交法分别对 5 5份肺结核病患者和 30份非结核呼吸系统病患者痰标本平行检测。结果 涂片法对结核病患者临床标本中MTB检出率为 2 1.82 % ,培养法检出率为2 5 .4 6 % ,PCR法检出率 36 .36 % ,PCR 微孔板反向杂交法检出率 4 7.2 7%。对 30例非结核呼吸系统疾病患者检测MTB ,PCR法出现 2例假阳性 ,其余 3种方法均阴性 ,PCR 微孔板反向杂交法比单纯PCR法灵敏度高、特异性强。结论 PCR 微孔板反向杂交法具有简便、快速、抗污染、灵敏度高、特异性强的优点 ,缺点是存在假阴性 ,应改进标本前处理方法 ,在对结核病的辅助诊断中应与细菌学方法相结合 。

建立检测嗜肺军团菌mip基因的PCR-微孔板反向探针杂交法

近年来随着对军团菌基因水平的深入研究和聚合酶链反应（ＰＣＲ）及其相关技术的不断发展，为军团菌检测提供了一个快速、敏感、特异的诊断方法，并已用于环境水和临床标本中的军团菌检测，具有较好的检测效果［１］。但是，要使之成为常规的临床诊断方法，尚需不断完善和...

PCR-反向微孔板杂交法检测医学真菌初步应用

目的通过建立PCR-反向微孔板杂交法鉴定临床常见的致病真菌，为临床治疗提供可靠依据。方法应用通用引物对真菌ERG11基因的保守序列进行扩增，扩增片段包被于微孔板中，再将真菌特异性引物与之杂交，经漂洗后显色，读取450nm处吸光度值判断结果。结果8种真菌特异性探针不与其他种的真菌、细菌和人类DNA分子杂交，而只和其对应的真菌DNA扩增产物反应，呈现阳性杂交结果。55例临床血液病、肿瘤等患者的血液、脑脊液及痰等标本分别用PCR一反向微孔板杂交法和真菌培养法（API20C）鉴定，2种方法的结果基本一致（阳性率分别为34．5％和30．9％）。结论PCR-反向微孔板杂交法可用于临床不同标本致病真菌的检测。

PCR-微孔板杂交-ELISA法检测巨细胞病毒感染

建立PCR-微孔板杂交-ELISA法检测人血清标本中巨细胞病毒DNA。将5’端标记生物素的PCR扩增产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合,90℃ 2min,55℃,1min杂交。杂交后产物被链霉亲和素酶标板固定,经酶标记抗地高辛标记抗体结合显色。本试剂检测灵敏度为2.5×104 copies/mL,比传统PCR和ELISA敏度性高,特异性强,与单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型,风疹病毒、EB病毒、腺病毒核酸无交叉反应,批内CV为8.9%,批间CV为10.5%。该法可用于定性和定量检测HCMV DNA。

PCR-微孔板杂交检测端粒酶活性方法的建立及初步应用

目的 建立聚合酶链反应 -微孔板杂交法检测端粒酶活性的方法及应用于临床。方法 利用 Kim法处理样品及扩增端粒酶产物 ,引物 TS标记生物素 ,扩增产物与包被有亲合素的微孔板结合 ,并与标记地高辛特异探针杂交 ;与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应 ,经 PNPP显色。结果 该方法最佳实验条件为探针浓度 2 .5μmol/L,杂交时间 1 h,批内变异系数为 9.5% ,批间变异系数为 1 6.5%。在 2 9例各种恶性肿瘤组织 ,端粒酶活性总检出率为 89.6% ,而在 1 7例炎性包块与良性增生组织为 1 1 .8% ,7例正常组织中未发现有端粒酶活性。结论 该法灵敏度与重复性较好 ,简便快速 ,成本低 。

PCR-微孔板杂交法检测不同人群TTV DNA

根据报道的TTV全序列设计引物和探针 ,建立PCR 微孔板杂交法 ,检测 81例正常人群、92例职业献血员 12 3例甲～庚型肝炎、32例非甲～庚型肝炎、48例原发性肝癌患者的TTVDNA。结果表明TTV在以上五种人群中的阳性率分别为 3.7%、4.3 %、2 1.1%、2 8.1%、5 2 .0 % ,前者与后三者比较有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,TTV合并HBV二重感染占重叠感染的 5 4.0 %。这揭示不同人群均存在TTV感染 ,正常人群和职业献血员存在健康携带状态 ,甲～庚型肝炎和非甲～庚肝炎病人为高危人群 ,TTV可与各型肝炎存在重叠感染 ,TTV除经血传播外 ,存在其它传播途径 ,TTV感染与ALT及TBIL的升高密切相关。

端粒重复序列扩增法结合微孔板杂交法定量检测端粒酶活性

目的探讨定量检测端粒酶活性的非放射性检测方法。方法将端粒重复序列扩增测定法（ＴＲＡＰ）与微孔板杂交 相结合建立了非放射性检测方法，对３例正常肝组织和４例肝癌患者治疗前后的肝癌组织、瘤旁组织、肝癌凋亡组织 进行检测。结果肝癌组织具有比较高的端粒酶活性，而正常肝组织和瘤旁组织无此酶活性，肝癌凋亡组织端粒酶活性 显著降低。结论 该定量分析方法简单、灵敏、特异性强，可以比较准确地反映组织的端粒酶活性状态。

微孔板杂交法检测结核分枝杆菌的初步临床应用

目的 :对 PCR-微孔板杂交法的临床应用进行评价。方法 :取临床标本 2 6 8份分别进行抗酸染色、培养、PCR扩增产物电泳、PCR微孔板杂交四种方法的比较。结果 :在 2 16份临床高度怀疑有结核分枝杆菌感染的患者标本中 ,PCR-微孔板杂交法检出阳性为 98例 ,其检出率高于 PCR-电泳法 (91/ 2 18)、培养法 (81/ 2 18)和抗酸染色法(5 6 / 2 18)。5 0份临床证实无结核分枝杆菌感染的病人标本 ,四种方法均未能检出结核分枝杆菌。结论 :PCR-微孔板杂交法是高度敏感。

微孔板杂交法检测肺癌端粒酶活性的研究

目的 :研究肺癌端粒酶活性及其临床应用价值。方法 :采用端粒重复序列扩增—微孔板杂交法 ,对 10 0例切除肺癌标本 ,分别取癌中央组织、癌旁 1cm、远癌组织 3块组织 ,进行端粒酶活性分析 ,同时送病理检查。结果 :端粒酶在肺癌组织中央部位的阳性检出率为 10 0 % ,癌旁 1cm为 84% ,远癌组织为 8% ,不同病理类型的肺癌端粒酶活性水平 ( A/mg蛋白 )分别为 :鳞癌 2 8例 0 .12 2 ,腺癌 6 8例 0 .12 5 ,小细胞癌 4例 0 .12 7,无显著性差异。结论 :端粒酶活性在切除肺癌标本中的测定 。

聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核杆菌的临床应用及其评价

目的 对聚合酶链反应 ( PCR) -微孔板杂交法检测结核杆菌的临床适用性和可行性进行评价。方法 收集 1130份临床标本 ,分别用抗酸染色、培养、PCR电泳及 PCR微孔板杂交法进行结核杆菌检测 ,并结合临床诊断和疗效观察对实验结果进行分析。结果 10 0份临床证实无结核病的体液标本经抗酸染色和 PCR电泳 ,分别有 1例和 2例假阳性 ,但经培养和 PCR微孔板杂交法未查出阳性 ;其余 10 30份高度怀疑含有结核杆菌的体液标本的检测结果 ,以 PCR微孔板杂交阳性检出例数最高 ( 481/ 10 30 ) ,其次为 PCR电泳 ( 40 6 / 10 30 )、培养 ( 36 5 /10 30 )以及抗酸染色 ( 2 5 6 / 10 30 ) ;χ2 检验结果显示 ,PCR微孔板杂交的结核杆菌阳性检出例数与其它三种方法比较均呈显著或极显著性差异 ( P<0 .0 0 83及 P<0 .0 0 17)。结论 PCR-微孔板杂交方法是特异、灵敏、准确、快速的结核杆菌检测方法 。

应用PCR-微孔板杂交法快速检测矽肺患者痰中结核分枝杆菌

矽肺患者是结核病的易感人群，结核能促使矽肺病变的进展，而矽肺也能影响结核产治疗效果并加剧其恶化，结核是矽肺患者最常见的并发症，也是矽肺患者主要的死亡原因之一。因此快速、早期诊断矽肺合并结核感染，对保护工人健康、降低矽肺患者的死亡率是十分必要的。

PCR-微孔板核酸杂交技术检测肺炎衣原体研究

建立一种新的PCR ELISA技术模式 ,简便、特异、敏感地检测肺炎衣原体 ,为肺炎衣原体的检测提供一种有效的新方法。采用链霉亲和素包被于聚乙烯微孔板 ,生物素标记的引物扩增目的DNA片段与荧光素标记的探针在微孔板内进行分子杂交 ,抗荧光素标记的辣根过氧化物酶可以与之结合 ,再加入底物即可产生颜色反应 ,通过测定其吸光度来进行结果判断。新建立的PCR ELISA方法与其它相关的六种病原体无交叉反应 ,临床标本检测检出率高 ,呼吸道感染者标本 42份检出率达 2 1 95 % ,肺炎患者标本 465份检出率为 42 1 5 % ,比套式PCR方法及其它检测方法的检出率都高。应用新建立的PCR ELISA方法检测肺炎衣原体特异、敏感 ,结果客观、稳定、可靠 ,对肺炎衣原体引起的疾病的诊断有十分重要的意义。

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 应用半巢式聚合酶链反应 -微孔板杂交法 (半巢式PCR -MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 1 0倍 ,半巢式PCR -MPH法特异性强。该法重复法好 ,批内CV值 <1 0 % ,批间CV值 <1 5 % ;该法在包被浓度为 4mg L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 1 0pmol mL探针杂交 3 0min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、敏感性和特异性均高 ,无放射性和EB染料污染 ,适于临床样本的常规检测。

端粒重复扩增-微孔板杂交法检测妇科肿瘤端粒酶活性的研究

目的 :探讨妇科几种常见恶性肿瘤与端粒酶活性的关系。方法 :采用端粒重复扩增 (TRAP)扩增端粒酶产物 ,通过生物素 -亲和素将扩增产物结合于微孔板 ,并与荧光素 (FITC)标记的特异性探针杂交 ,经酶标抗荧光素抗体结合而显色。结果 :妇科恶性肿瘤端粒酶活性检出 2 5例 (89.3% ) ,而肿瘤边缘组织检出 14例 (5 0 .0 % ) ,正常对照组织检出 10例 (35 .7% )。恶性肿瘤端粒酶活性显著高于肿瘤远端组织和正常对照组织 (P<0 .0 5 )。结论 :端粒酶激活可能在妇科恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用。 TRAP-微孔板杂交法是检测端粒酶活性灵敏而特异的一种方法。

微孔板杂交法检测端粒酶活性

目的 利用微孔板反向杂交法对端粒酶重复序列扩增法加以改进 ,建立一种快速、简便、量化的端粒酶活性检测方法。方法 将端粒重复序列扩增法 (TRAP)与微孔板杂交法相结合 ,并采用蜡珠包埋活性酶及引物的方法 ,使TRAP反应单管一次完成。结果 与TRAP法相比 ,该方法检测鼠骨髓瘤细胞株的敏感性为 10个细胞 ,检测肝癌标本为阳性 ,经RNase处理及加热处理的细胞和标本及正常细胞均呈阴性。结论 应用该方法可简便、快速检测端粒酶活性 ,1日内完成并可单人份操作 ,对临床试剂的建立具有一定的参考价值。

PCR微孔板核酸杂交法检测Ng、Ct、Uu、HPV结果分析

淋病奈瑟菌(Ng)、沙眼衣原体(ct)、解脲支原体(uu)、人类乳头瘤病毒(HPV)是常见的性传播疾病(STD)的病原体。为了解上述病原体在凯里的感染情况。我们于1999、9～2000．8月，采用PCR微孔板核酸杂交法对高度怀疑为性传播疾病患者284例进行了Ng、Ct、Uu、HPV的检测，结果报如下。