PCR-焦磷酸测序法快速鉴定食品中肠炎沙门菌

通过对肠炎沙门菌特异性基因片段的焦磷酸测序,达到快速鉴定肠炎沙门菌的目的。设计PCR扩增引物和焦磷酸测序引物,对PCR扩增产物进行焦磷酸测序,测得序列进行BLAST比对分析。通过对肠炎沙门菌特异性基因上的30个碱基片段进行测定,可准确鉴定16株肠炎沙门菌。所建立的方法可以从基因序列水平上准确鉴定肠炎沙门菌,具有快速、准确的优势。

PCR-焦磷酸测序法快速检测和鉴定临床常见致病菌的研究

焦磷酸测序（Pyrosequecing）技术为近年新一代短片段DNA序列分析技术。国外主要用于分子流行病学的单个核苷酸多态性位点大容量快速检测和临床微生物菌种鉴定与分型，但国内尚未开展。本研究刚该技术对针对不同细菌的独特分子标志，设计基于PCR技术的快速菌种鉴定方法，以提供从分子水平快速鉴定菌种的新的可靠方法。

PCR-焦磷酸测序技术检测奶牛乳房炎4种主要致病菌方法的建立

应用PCR-焦磷酸测序技术(pyrosequencing)一种新型快速检测奶牛乳房炎(bovine mastitis)4种主要致病菌无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)、沙门氏菌(Salmonella sp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的方法。根据GenBank中无乳链球菌的sip基因、停乳链球菌的isp基因、沙门氏菌的stn基因和金黄色葡萄球菌的clfa基因的序列信息,分别设计各基因保守区段的PCR扩增引物及焦磷酸测序引物。分别以108株无乳链球菌、100株停乳链球菌、136株沙门氏菌、203株金黄色葡萄球菌,以及多株其他参照菌为模板,轮流使用上述各扩增引物进行PCR扩增目的基因片段。随后采用焦磷酸测序技术针对阳性PCR扩增片段进行核苷酸保守区段的测序分析。最终得到预期的PCR扩增和焦磷酸测序结果,且实验结果具有可靠的重复性。PCR-焦磷酸测序技术适用于上述奶牛乳房炎4种主要致病菌的检测鉴定,具有准确、快速等优点。

焦磷酸测序法在HBV阿德福韦酯耐药检测中的应用

目的评价焦磷酸测序法在慢性乙型肝炎(CHB)患者阿德福韦酯(ADV)耐药检测中的应用。方法选取ADV治疗失败的CHB患者,采用PCR产物焦磷酸测序法检测ADV耐药相关的rtA181V/T和rtN236T变异,并与PCR产物双脱氧测序法进行比较。计算两种方法的耐药检出率及采用焦磷酸测序法检出的变异株在病毒群中所占的比例。结果共入选患者210例,经双脱氧测序法与焦磷酸测序法检测共确认耐药变异患者67例,耐药变异位点92个,其中焦磷酸测序法检出耐药患者64例(95.52%)、变异位点86个(93.48%),双脱氧测序法检出耐药患者52例(77.61%)、变异位点71个(77.17%),两种方法结果符合率为83.8%。焦磷酸测序法检出44例发生单位点变异的患者,其中变异株比例<50%的患者26例,最低耐药株比例为6.5%。rtA181T、rtA181V、rtN236T变异的平均变异株比例分别为34.12%、61.23%、59.69%,其中rtA181V与rtN236T的变异株比例无明显差异(P=0.909),但均高于rtA181T的变异株比例(P<0.01,P<0.05)。结论焦磷酸测序法的ADV耐药检出率优于双脱氧测序法,前者可进一步计算患者体内变异株的比例;在大部分患者中检出耐药时变异株不一定是优势株。

焦磷酸测序技术快速测定肾移植受体人群CYP3A5~*3基因多态性方法的建立

目的建立基于焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)的肾移植受体CYP3A5*3基因多态性的简单、快速、准确、高通量的检测方法。方法提取221例肾移植受体和200例健康人外周血基因组DNA,应用Pyro-MarkID焦磷酸测序仪进行焦磷酸测序,采用Sanger法DNA测序作为标准对照,观察分析焦磷酸测序法的可靠性,并分析肾移植受体人群CYP3A5*3多态性的分布。结果建立了基于焦磷酸测序技术的CYP3A5*3基因多态性检测新方法,实现了DNA标本的快速、可靠、高通量检测,经重复性检测和Sanger标准法DNA测序可靠性检测,用焦磷酸测序技术检测CYP3A5*3多态性的突变检出率及重复率均达100%。221例肾移植受体CYP3A5*3基因型分布:*1/*1型为23例(10.4%),*1/*3型为89例(40.3%),*3/*3型为109例(49.3%),与正常人群比较等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论与传统的测序方法相比,焦磷酸测序法能够简单、快速、准确地测定肾移植受体CYP3A5*3基因型,适合临床推广应用。

焦磷酸测序法与Sanger测序法检测CYP2C19*17基因多态性方法学对比研究

随着个体化诊断与个性化用药相关研究的进展，由CYP2C19引起的药物氧化代谢个体差异和种族差异越来越引起临床重视，大量内源性底物和临床应用的大约2%的药物均由 CYP2C19催化代谢[1]，如对抗癫痫药物[2]（丙戊酸和苯妥英钠等）、质子泵抑制剂[3]（奥美拉唑、兰索拉唑等）、抗抑郁药[4]（西酞普兰等）的代谢影响，其基因多态性是引起同一药物在不同个体和种族间表现出不同代谢能力的主要原因之一[5]。其中，CYP2C19＊2、CYP2C19＊3和CYP2C19＊17在人群中所占比例较高，前两者相对于酶的活性是下调作用，目前临床检测较为广泛。而 CYP2C19＊17对酶的活性是上调作用，等位基因突变占亚洲人群比例为5%。

异柠檬酸脱氢酶1基因突变焦磷酸测序检测方法的建立

目的建立异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)基因突变的焦磷酸测序检测方法,确定该方法的检测灵敏度。分析焦磷酸测序法与直接测序法对于鉴定IDH1突变的差异。方法构建携带野生型和突变型IDH1基因的质粒,使用质粒优化焦磷酸测序方法。使用已知比例的野生型和突变型质粒作为模版,确定突变的检测灵敏度。针对96例胶质瘤患者手术切除标本的基因组DNA,分别使用直接测序法和焦磷酸测序法,鉴定IDH1基因突变类型,并比较。结果使用焦磷酸测序能够检测到低至2%的IDH1突变。直接测序检出突变阳性率为32.3%、焦磷酸测序检出突变阳性率为74.0%。结论焦磷酸测序法检测IDH1基因突变灵敏可靠,适合临床分子诊断。

PCR-焦磷酸测序法快速鉴定菌血症病原菌

世界范同内成人和儿童菌血症都是高发病率和高死亡率的疾病，每年世界范围内菌血症患者有2000万例。因病原菌不能鉴定而应用广谱抗生素或不适当抗生素治疗所导致的死亡率非常高，但欧洲每年仍有135000例患者死于菌血症，在美国更是高达215000例。

荷斯坦牛瓜氨酸血症焦磷酸测序检测方法的建立与应用

为建立一种快速高通量的荷斯坦牛瓜氨酸血症(Citrullinemia,CN)分子检测方法,依据CN是由于精氨酸琥珀酸(ASS)合成酶基因编码第86位精氨酸的密码子突变为终止密码子的遗传学基础,利用Assay Design SW软件设计了1对引物和1条测序引物对三种不同基因型的基因材料进行测序分析。用建立的方法对55份进境荷斯坦牛血样进行检测,发现有1例为隐性基因携带者,将PCR产物进行常规测序,结果与焦磷酸测序检测结果一致。研究表明该方法可用于荷斯坦牛瓜氨酸血症的检测,是一种有效的新方法。

高灵敏度焦磷酸测序法定量测定基因组DNA拷贝数的变化

唐氏综合征（DOWN’S syndrome DS）又称先天愚型，21-三体综合征，是人类最常见的染色体异常引起的疾病之一。新生儿发生率为1／800～1／600，一般随着产妇年龄的增大，胎儿患有DS的风险就会提高。针对本病，目前没有有效的治疗方法，因此唯一有效可行的措施是产前筛查，早期发现，早期诊断，及时终止妊娠，避免DS患儿的出生。

焦磷酸测序法检测ALDH2*2和MTHFR 677基因多态性的性能验证

目的对实验室自建焦磷酸测序法检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)*2和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)677基因多态性的方法进行性能评价。方法对不同浓度(10.0、2.0、0.4、0.0ng/μL)的杂合型DNA标本进行检测,评价方法的检出限;采用经焦磷酸测序法验证的DNA标本的PCR产物各20例,与Sanger测序法进行比较,评价方法的准确度;对3种(野生、杂合和突变型)基因型标本重复检测4次,评价方法的重复性。结果焦磷酸测序法检测ALDH2*2和MTHFR 677多态性的检出限为2ng/μL基因组DNA;焦磷酸测序法的分型结果与Sanger测序法一致,准确度为100%;批内重复4次检测结果完全一致。结论焦磷酸测序法检测ALDH2*2和MTHFR 677基因多态性稳定可靠,满足江苏省临床检验中心的要求,可用于临床检测。

无牙颌患者口腔菌群组成的焦磷酸测序分析

目的研究无牙颌患者的口腔菌群组成。方法收集11例无牙颌患者口底/舌腹、舌背、唇颊前庭、硬腭/牙槽嵴顶、唾液中的菌斑样本,构建细菌16S rRNA基因文库,采用焦磷酸测序法对16S rRNA基因的V2-V3可变区进行序列分析,完成无牙颌患者口腔菌群的物种鉴定。结果 11例无牙颌患者共测得51 091条16S rRNA基因序列,主要分布于厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门,多为链球菌属、奈瑟菌属、卟啉单胞菌属、罗氏菌属等,优势菌种为缓症链球菌、毗邻颗粒链菌、殊异韦荣菌、香茅醇假单胞菌、副猪嗜血杆菌、动物口腔奈瑟氏球菌、卟啉单胞菌、黏液罗氏菌。结论牙列缺失对无牙颌患者的口腔菌群组成有一定影响。

奶牛乳房炎病原微生物20联核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的临床应用评估

为了评估商品化的奶牛乳房炎病原微生物20联核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(后文简称为“检测试剂盒”)在临床应用中的适用性,本试验采用传统细菌分离培养、检测试剂盒、16S rRNA基因扩增子测序和药物敏感性试验对宁夏回族自治区9个牧场155份奶牛乳房炎奶样分别进行菌株鉴定和耐药性检测,并将检测试剂盒与其他3种检测结果进行比较和分析。结果显示,检测试剂盒与传统细菌分离培养在病原菌检出情况上基本保持一致,均主要检出了大肠杆菌、芽孢杆菌属和凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)等;检测试剂盒与16S rRNA基因扩增子测序结果在菌属组成上一致性较高,均主要检出了假单胞菌属、链球菌属和葡萄球菌属等;药物敏感性试验结果显示,检出率较高的66株病原菌分离株对β-内酰胺类抗菌药物的耐药率普遍偏高;奶样中β-内酰胺酶耐药基因blaZ的检测试剂盒检出结果与同一奶样中分离菌株的药物敏感性试验结果一致率达58%(7/12)。综上所述,该检测试剂盒具有较高的准确度和病原覆盖率,可为牧场奶牛乳房炎主要病原的快速诊断和耐药基因(blaZ)监测提供有效的技术支持,从而降低抗菌药物的使用量,以减少牧场经济损失。

一管式多引物焦磷酸测序技术在HPV分型检测中的应用

目的探讨一管式多引物焦磷酸测序技术在人类乳头瘤病毒(HPV)分型检测中的临床应用价值。方法设计针对7个不同HPV亚型的高度特异性测序引物,采用一管式多引物测序法,通过半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增获得HPV基因片段,并进行焦磷酸测序分析。结果通过半巢式PCR扩增和一管式多引物焦磷酸测序,成功区分了7种不同的HPV亚型,且测序结果与PCR-反向点杂交法检测结果的符合率是100%。结论一管式多引物焦磷酸测序技术是一种简便、高效、高通量、高灵敏度、高准确度的HPV分型检测方法,值得推广应用。

焦磷酸定量化检测配对盒家族基因1甲基化在宫颈癌诊断中的应用

目的检测配对盒家族基因1(PAX1基因)在不同程度宫颈病变组织中的甲基化表达水平,评估其作为宫颈上皮细胞癌变的分子标志物的诊断价值。方法 2011年1月—2013年4月在上海市闵行区中心医院妇科宫颈专科门诊就诊的121例患者的宫颈组织,以组织病理学诊断作为金标准,分为正常宫颈组(28例)、低级别病变组[病理诊断为宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级,32例]、高级别病变组(病理诊断为CINⅡ或Ⅲ级,34例)和宫颈鳞癌组(27例)。采用焦磷酸测序法检测抑癌基因不同位置的甲基化情况。采用受试者ROC曲线确定宫颈组织PAX1基因甲基化表达水平对宫颈病变的诊断阈值。结果正常宫颈组、低级别病变组、高级别病变组和宫颈鳞癌组间年龄(F=4.31,P<0.01)和高危人乳头瘤毒阳性构成比(χ2=79.43,P<0.01)的差异有统计学意义。正常宫颈组宫颈组织PAX1基因甲基化定量水平为(4.92±4.45)%,低级别病变组为(5.55±5.05)%,高级别病变组为(10.21±14.39)%,宫颈鳞癌组为(41.97±23.02)%,差异有统计学意义(F=46.43,P<0.001);两两比较发现,除正常宫颈组与低级别病变组之间差异无统计学意义外(P>0.05),其他各组之间差异均有统计学意义(P值均<0.01)。宫颈组织PAX1基因甲基化定量检测诊断宫颈鳞癌的ROC曲线AUC为0.883,敏感度为81%,特异度为93%,最佳界值为20.55%。宫颈组织PAX1基因甲基化定量检测诊断宫颈鳞癌和高级别病变的AUC为0.680,敏感度为57%,特异度为90%,最佳界值为8.97%。结论焦磷酸测序法PAX1基因甲基化水平定量检测较以往的定性分析有较大优势,对于宫颈癌临床诊断具有潜在应用价值。

PCR-荧光探针法检测婴幼儿和儿童人鼻病毒的初步评估

目的通过PCR-荧光探针法和Sanger测序法检测呼吸道感染婴幼儿和儿童人鼻病毒(HRV)的感染情况,以评估PCR-荧光探针法的病毒检测能力,并分析HRV载量对患儿临床指标的影响。方法收集2019年5—7月在遵义医科大学第三附属医院住院收治的具有呼吸道感染症状的175例患儿的鼻咽拭子标本,采用PCR-荧光探针法和Sanger测序法检测HRV感染情况并分析HRV载量对婴幼儿和儿童临床指标的影响。结果PCR-荧光探针法检出阳性标本51份(51/175,29.14%),阴性标本124份(124/175,70.86%)。Sanger测序法检出阳性标本48份(48/175,27.43%),阴性标本127份(127/175,72.57%)。与Sanger测序法相比,PCR-荧光探针法检测HRV的灵敏度和特异度分别为100.00%和97.64%,阳性预测值和阴性预测值分别为94.12%和100.00%,一致率为95.80%。两种方法对HRV的检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。高载量病毒组和低载量病毒组住院天数、入院前最高体温、发热天数、白细胞计数、淋巴细胞百分比及降钙素原比较,差异均无统计学意义(P>0.05),超敏C反应蛋白比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PCR-荧光探针法检测HRV灵敏度高、特异度高、检测周期短、费用较低且操作简便快捷,可在临床检测HRV中广泛推广。此外,高载量HRV的婴幼儿和儿童的超敏C反应蛋白水平较低载量HRV的婴幼儿和儿童更高。

基于高通量测序的废次烟末水提液中细菌群落分析

为了解造纸法再造烟叶生产过程中不同烟末提取液的微生物变化,利用Roche 454 FLX焦磷酸高通量测序法,比较废次烟末水提液中细菌16S rRNA基因序列的多样性,获得了废次烟末水提液中细菌种群的组成和丰度的变化。结果表明:在废次烟末水提液的原液(M1)、浓缩液(M2)及醇化液(M3)样品中,细菌种群组成非常丰富,其中占主导地位的细菌种群是厚壁菌门,而厚壁菌门中的优势菌属是乳杆菌属和赖氨酸芽孢杆菌属。从M1到M3的过程中,乳杆菌属丰度呈下降趋势,而赖氨酸芽孢杆菌属丰度呈上升趋势。基于高通量测序的细菌群落变化趋势可为改善造纸法再造烟叶的品质提供依据。

DNA测序技术

DNA测序,即基因测序,处于快速发展阶段,全球基因测序行业的市场规模巨大。从1990年人类基因组计划(HGP)正式启动以来,DNA测序应用的壮阔前景开始展现在人类面前。本文介绍了第一代到第三代DNA测序的原理,关注当前DNA测序的应用,并提出对于这一领域发展的看法和前景展望。

PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌研究

目的建立结合PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。方法根据单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因设计扩增引物和测序引物,特异地扩增目的片段,再制备单链模板,在测序引物引导下进行焦磷酸测序,通过测序结果与GenBank中的hly基因序列的比对进行鉴定。结果扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,16株单核细胞增生李斯特氏菌菌株均扩增出大小249 bp的DNA片段,焦磷酸测序结果与hly基因序列100%匹配,而阴性对照菌株均未扩增出DNA条带,焦磷酸测序结果为阴性。结论建立的方法特异性高,是快速从DNA序列水平上检测单核细胞增生李斯特氏菌的有效手段。