PCR-AFLP技术产前诊断唐氏综合征

目的 :建立临床可行的、高准确性的、快速产前诊断唐氏综合征的方法。方法 :应用聚合酶链反应—扩增片断长度多态性技术 ,选择 2 1号染色体上 4个具有高度多态性的 STR位点对 12例胎儿进行了产前诊断。结果 :在 12例胎儿的产前诊断中 ,检出 2例唐氏综合征患儿 ,与细胞遗传学检查结果一致 ,无假阴性和假阳性病例发生。结论 :选用 2 1号染色体上的 4个 STR位点具有高度的多态性 ,应用 PCR- AFL P技术检测各位点的基因型状况 ,产前诊断经典型和易位型唐氏综合征胎儿 ,准确性高 ,操作简便、快速 ,具有极好的临床应用价值。

优秀力量运动员ACE基因I/D多态性与运动能力的关联研究

为探讨血管紧张素Ⅰ转化酶 (ACE)基因I/D多态性与运动能力的关系 ,并力求寻找相关的遗传标志 ,应用PCR -AFLP(扩增片段长度多态性 )方法检测了优秀力量运动员和普通人群的ACE基因型。结果显示 ,优秀运动员组ACE等位基因频率D =0 375 ,I=0 6 2 5 ,I等位基因频率高于普通人群组 (I=0 45 0 ) ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。提示ACE基因I/D多态性可能与运动能力相关联 ,考虑将其作为遗传标志用于运动员科学选材。

基于ISSR和AFLP标记开发甜菜SSR引物

基于AFLP和ISSR标记原理,采用基因组步移技术,建立了一种新的分离甜菜基因组微卫星引物的方法。具体步骤为:(1)构建基因组DNA限制性内切酶文库,ISSR引物扩增文库中两端含微卫星序列的片段并进行克隆测序,根据测序结果设计微卫星序列间的引物IP1和IP2;(2)巢式PCR进行基因组步移,扩增IP2引物下游序列并测序,进而设计微卫星引物IP3,引物IP2和IP3即为SSR标记引物。对获得的SSR引物进行PCR验证,结果表明,SSR引物产率为16%,研究获得的SSR引物具有较高的多态性,对于后续的遗传多样性检测和遗传连锁图构建具有重要意义。

植物病原菌黄单胞菌的分类研究进展

黄单胞菌是一类重要的植物病原细菌。由于其经济重要性,对该属细菌进行了大量的研究,方法包括DNA杂交、基于代表性序列的多聚酶链式反应技术和扩增片段长度多态性(AFLP)基因组指纹图谱技术等。本文主要介绍了黄单胞菌属的分类研究进展。

AFLP分子标记及其在作物遗传育种中的应用与前景

AFLP是一种基于PCR技术的新的分子标记 ,也是一种可靠而又理想的遗传标记方法。本文简述AFLP的发展、原理、方法与特点 。

杨树幼茎特异表达基因及PsnLAC基因的克隆

利用cDNA-AFLP技术对小黑杨茎、叶基因的差异表达进行分析。结果表明,64对引物组合在茎和叶中共扩增出4 192条带,其中差异条带2 275条。通过对茎中特异表达基因的克隆和测序,获得了4条cDNA序列。经Blast-x比对分析表明,它们分别是类伸展蛋白、漆酶、过氧化物酶和细胞壁相关水解酶。进行RT-PCR分析发现,4个基因在茎中的表达水平明显高于叶和根。其中,以漆酶的基因片段为基础进行生物信息学分析和设计引物,用RT-PCR技术克隆到了1 413 bp包含开放阅读编码框的cDNA片段,其开放阅读编码框长度为1 020bp,编码339个氨基酸残基,与来自其他植物漆酶的氨基酸序列具有较高的同源性。

茶树冷诱导基因的AFLP筛选及其表达分析

以中小叶茶树良种舒茶早和云南大叶种73-11为材料,于4℃低温处理4 d后,采用AFLP技术筛选出冷诱导下茶树差异表达基因并进行分析.结果显示,实验共获得41个差异片段(TDFs),其中舒茶早产生19条差异条带,73-11产生38条差异条带,两品种共有条带16条.所获得的差异片段按功能可划分为4类,即信号传导蛋白、转录因子、基础代谢相关蛋白、抗逆蛋白质,此外还有一些假设蛋白质以及未知蛋白.利用qRT-PCR对Kh1、Kh3和Kh11差异片段进行验证,结果显示这3个片段均被低温诱导,表达量上升.研究表明,茶树在低温胁迫下的逆境反应非常复杂,涉及多种代谢过程中的众多基因,而且大叶种比中小叶种对低温反应更为敏感.

运用cDNA-AFLP技术初步鉴定两种方法合成的cDNA的指纹图谱

在植物基因克隆以及构建cDNA文库时,都需要合成高质量的双链cDNA,并要达到一定的数量。然而研究者经常受到试验样品量的限制。特别是比较稀少的植物材料,例如植物的根尖、茎尖或花的雌、雄蕊等,难以获得足够的RNA,以致影响cDNA的合成量,无法开展下游的实验。以PCR为基础合成第二链cD-NA的Smart技术(LD-PCR),能够以50ng的总RNA为反转录模板合成高质量的双链cDNA。但研究者对第二链采用PCR方法是否有些基因信息丢失或丰度上发生很大的变化存有疑虑。针对以上存在的问题,通过置换合成和长距离PCR(LD-PCR)两种方法合成3个月的梭梭幼苗茎尖双链cDNA,EcoRI和MseI限制性内切酶双酶切后,用16对选择性扩增引物对两种cDNA进行cDNA-AFLP的指纹图谱分析。结果表明,置换合成和LD-PCR两种方法合成的cDNA指纹图谱中,分别有条带约495条和470条。其中,相同的条带共计433条,不同的条带分别有62条和37条,分别为各自合成方法总指纹数的12.5%和7.87%,相同的指纹信息达87%以上。这说明两种方法合成的cDNA存在着较大的差异,合成方法对cDNA合成质量的影响较大,为研究人员选用何种cDNA合成方法提供了借鉴。

分子标记技术在寄生虫分类鉴定上的应用

分子标记与形态标记、细胞学标记和生化标记3类遗传标记技术相比,具有直接以DNA的形式表现,在动物的任何生长阶段都可检测,遍布整个基因组,多态性高,检测手段简单迅速,无基因多效性,能够明确辨别等位基因,试验重复性好等优点。目前,在寄生虫分类鉴定上常用的分子标记技术有RFLP,PCR-RFLP,RAPD和AFLP。文章综述了4种分子标记技术的基本原理、主要优缺点以及在寄生虫分类鉴定中的应用情况。

采用AFLP和ERIC-PCR技术研究规模化鸡场健康鸡群中产气荚膜梭菌的遗传多样性

为了调查产气荚膜梭菌在健康鸡群中的流行现状,掌握我国部分地区规模化鸡场产气荚膜梭菌的遗传多样性,分析其流行特点与地区差异的关系,利用AFLP(amplified fragment length polymorphism)和ERIC-PCR(en-terobacterial repetitive intergenic consensus PCR)方法对从四川省8个市10个规模化鸡场分离得到的34株A型产气荚膜梭菌进行基因型分析。结果表明,用AFLP技术将34株菌分为12个亚型,用ERIC-PCR方法分为8个亚型。分析亚型分布情况发现:不同鸡场产气荚膜梭菌的亚型差异明显;而同一鸡场的亚型较简单,以一种亚型为主,交叉有少数其他亚型;优势基因型分别为AFLP基因Ⅷ型或ERIC-PCR基因1型。该研究结果说明:四川省规模化鸡场健康鸡群中产气荚膜梭菌的遗传多样性较低,其流行特点与地区差异相关。

PEX法提取植物组织DNA

介绍了一种简单而实用的DNA提取法,利用PEX试剂从高粱与转基因玉米的新鲜叶片中提取植物组织DNA。所得DNA经定量检测后,可满足AFLP分析及PCR-Southern杂交等要求。

现代分子生物学技术在木霉鉴定及多样性分析中的应用

木霉是一类重要的生防真菌,具有很大的农业应用潜力。对分离培养的木霉准确鉴定,对其在农业生产中的应用至关重要。近年来,分子生物学技术在木霉鉴定方面得到了广泛应用,本文综述了rDNA-ITS序列分析、通用引物PCR(UP-PCR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)等分子技术在木霉鉴定与多样性分析中的应用。

利用cDNA-AFLP技术分析小麦成株抗条锈性差异基因表达特征

采用cDNA-AFLP技术,对成株抗条锈小麦品种兴资9104在成株期受条锈菌生理小种CY32侵染后5d内9个时间点的基因表达谱进行了分析。共筛选64对引物,产生32320个转录本(TDF);用37对引物检测到2201个(6.81%)差异TDF,其中926个TDF诱导表达,1275个下调表达。经大规模克隆、测序分析,最终获得330个差异TDF,聚类分析得到259个EST(unigenes),命名为aTaPST1至aTaPST259(GenBank登录号为FL645754～FL646011和FL646262)。经Blastx比对和功能分类分析,其中96条EST(37.07%)未找到同源性匹配,68条(26.25%)与未知功能蛋白同源性较高;其余95条ESTs主要涉及能量(11.20%)、基础代谢(4.63%)、转录调控(3.86%)、抗病与防御(3.86%)、蛋白质运输和储存(3.09%)、蛋白质合成和细胞生长(各2.32%)以及信号转导(1.54%)等。选取抗病与防御、转录调控及信号转导类等相关的6个差异基因,qRT-PCR分析结果显示其表达模式符合cDNA-AFLP表达谱。小麦成株抗条锈性分子机制涉及植物多方面生理生化反应,包括抗病与防御、转录调控、蛋白质代谢、信号转导、以及非生物胁迫等多种途径相关基因的协同控制。

板栗花序与叶的cDNA-AFLP的差异表达分析(英文)

为给板栗的分子遗传育种工作提供重要的分子数据参考,作者通过cDNA-AFLP的方法,以同株板栗幼年花序和叶片为实验材料,在转录水平上进行差示分析。结果显示:64对引物组合共产生了2131条PCR产物,对其中的110条克隆测序,发现有28条基因与已知功能基因相关,其中包括参与植物转运﹑代谢﹑能量产生相关的蛋白,从而证明这些基因在板栗生长发育中的重要作用。

深圳市中央空调冷却塔水军团菌AFLP分型研究

目的 了解深圳市中央空调冷却塔水中军团菌的多态性，分析优势种群和菌型分布，为建立军团菌分子型别库提供资料。方法 运用The European Working Group for Legionella Infections（E．W．G．L．I）组织制定的扩增片断长度多态性分型（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）方法，对深圳市中央空调冷却塔水中军团菌进行分子分型。结果 按照血清分型方法，将冷却塔水中军团菌分为Lp1、Lp2-14以及非嗜肺型，运用AFLP技术对50株军团菌菌株分型，结果将22株Lpl血清型分为7种AFLP型，分别记为AFLP1—7，以AFLP2型与AFLP5型为主要型别；20株Lp2-14血清型分为7种AFLP型，分别记为AFLPⅠ—AFLPⅦ，以AFLPⅠ、Ⅱ为主要型别；9株非嗜肺军团菌血清型分为5种AFLP图谱。结论 AFLP分型技术能初步分析深圳市军团菌优势种群，为对军团菌监测及致病性军团菌型别的分析提供基本资料。

蜡梅AFLP-银染体系的建立与优化

为了建立蜡梅AFLP-银染的优化体系,采用EcoRⅠ和MseⅠ 2种限制性内切酶酶切组合,对该2种酶的用量、酶切时间、预扩增与选择扩增中的Mg^2＋浓度、Taq DNA聚合酶的用量、引物的浓度以及预扩增产物的稀释倍数等因素进行了多水平的筛选,同时探讨了温度及聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的电流强度等因素对胶图的影响。结果表明：用5 U限制性内切酶酶切4 h便能在40μL的反应体系中完全切割500 ng的总DNA,酶切连接产物稀释10倍后在含有1.5 mmol/L Mg^2＋1、U Taq、预扩增引物E＋A和M＋C分别为40 ng的20μL反应体系中进行预扩增,将预扩增产物稀释30倍后在含有1.5 mmol/L Mg^2＋、0.6 U Taq、选择扩增引物E＋3为30 ng、M＋3为60 ng的20μL的体系中进行选择性扩增,能够得到质量比较好的AFLP胶图。此外,在进行PAGE电泳和硝酸银染色,将电泳的温度控制在50℃左右,电流控制在45～60 mA左右能提高胶图的质量。利用这种优化的反应体系,成功地评价了40个蜡梅基因型的遗传多样性,6对选择扩增引物组合表现出较高的稳定性、清晰度和多态性,它们分别是：E-AAC/M-CCC,E-ATC/M-CCC,E-AGA/M-CAG,E-AAA/M-CAC,E-ATA/M-CCA,E-ATT/M-CCA。

耧斗菜属AFLP体系的建立和优化

通过对AFLP反应体系的主要的四个影响因素:Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物进行四水平筛选试验,利用三种耧斗菜Aquilegia parviflora、A.viridiflora、A.vulgaris优化了耧斗菜属的AFLP反应体系,采用64对引物组合对三种耧斗菜进行了PCR扩增和聚丙烯酰胺电泳检测。其中9对引物组合表现出较高的稳定性、清晰度和多态性。初步建立了耧斗菜的AFLP反应体系,得到质量比较好的AFLP胶图。从而为AFLP分子标记技术应用于耧斗菜属的研究奠定坚实基础。

中华稻蝗AFLP反应体系的建立与优化

以中华稻蝗为研究材料,提取到高质量的总DNA。通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等实验条件,确定了AFLP银染技术方法,从而建立了中华稻蝗AFLP分子标记研究体系,得到了清晰的AFLP指纹图谱,为探讨稻蝗种间遗传学关系提供了新的技术手段。

番木瓜不同性别基因表达cDNA-AFLP分析

在番木瓜幼苗期,利用cDNA-AFLP技术鉴定植株性别并分析不同植株性别基因表达的差异;通过对差异表达基因进行序列和功能分析,探讨调控番木瓜性别分化的分子机理。结果表明,每次反应扩增获得的稳定条带总数为25～75条,番木瓜3种植株性别基因表达存在明显差异,每种性别植株都有特异性条带,其中雄性株14条、雌性株13条、两性株9条。将获得的部分差异TDFs序列与GenBank数据库中的所有序列进行Blastx和Blastn比对,其中一部分差异片段为未知功能基因序列,另一部分差异片段序列与谷胱甘肽转移酶基因、植物甾醇类激素合成相关基因、分裂原活化蛋白酶基因、与端粒相连的核酸序列、杨树叶中克隆的未知功能基因及拟南芥花和花蕾中克隆的未知功能基因等具有较高的同源性。因此,cDNA-AFLP技术可在幼苗期鉴定番木瓜的植株性别,不同番木瓜植株性别基因的差异表达可能是其植物体一系列功能基因调控植株性别发育及生长发育的综合反应。

梅根系丛枝菌根真菌AFLP分析

为了解决梅根系共生的丛枝菌根(AM)真菌难以应用形态学鉴定的问题,以巢式PCR的AFLP方法研究梅根系AM真菌DNA多态性。试验采集梅花期的根系样品,应用改良CTAB法提取总DNA,经纯化处理后,应用巢式PCR扩增根系AM真菌基因片段,进行AFLP分析。结果表明,18个梅品种的30个根系样品中,仅有8个样品经巢式PCR后获得纯化的DNA片段,占试验样品数的26.7%;8个样品共得到指纹图谱带24条,各样品平均多态性位点数为3.0个,Nei’s基因多样性为0.4097±0.0848,Shannon信息指数为0.5968±0.0955;利用Nei’s遗传相似性系数聚类,梅品种根系内AMF基因组DNA的聚类类别与梅"品种群"这一分类级别无相关性。该试验为植物根系共生AM真菌DNA多态性研究提供了一种简便的技术。