聚合酶链反应-酶联免疫法筛选孢子丝菌特异性探针

目的筛选出对孢子丝菌结合效率相对较高的探针。方法以50株纯培养的孢子丝菌及标准株为样本,以毛霉、烟曲霉、念珠菌各1株为阴性对照,用聚合酶链反应-酶联免疫法(PCR-ELISA)对已报道的5个孢子丝菌特异性探针(U26852、U26866、U26866'、M85053及AF117945)进行筛选。记录各探针与合成DNA片段杂交底物显色与否及酶免疫测定指数(EI)值。结果 PCR产物测序证实5个探针均位于产物序列上;在相同的ELISA条件下,探针U26852显色最强,EI值最高。结论针对28Sr RNA的探针U26852是目前与孢子丝菌结合效率相对较高的探针。

Taq Man MGB探针实时聚合酶链反应检测白纹伊蚊体内登革病毒

目的初步研究TaqManMGB探针实时聚合酶链反应(TaqManMGBRealtimePCR)检测白纹伊蚊登革病毒的敏感性,建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Denguevirus,DV)鉴定方法。方法在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den2型病毒,设不同的感染蚊虫浓度(只/500μl或只/1000μl)和不同的分组方法(不加未染毒的蚊虫、分别用未染毒的实验室饲养的雌性白纹伊蚊补加到每份标本10、25、50只/组),利用一步法和二步法TaqManMGBPCR检测,根据荧光信号判断结果。结果二步法TaqManMGBPCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为2只/500μl和3只/1000μl,一步法TaqManMGBPCR可检测到标本中感染蚊虫的最低浓度为5只/500μl,蚊自身的RNA对登革病毒RNA的检测敏感性并无明显的影响。结论TaqManMGB探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高,特异性好,是白纹伊蚊携带登革病毒指数较理想的监测方法,标本较好的处理方法为500μl标本处理液研磨20～30只/组,TaqManMGBRealtimePCR最好采用二步法。

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。

聚合酶链式反应(PCR)技术在临床检验中的应用

聚合酶链式反应是近年来发展起来的体外基因扩增技术,已经在很短的时间里迅速进入生命科学、医学研究、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学等各个领域。本文简要介绍这种技术在临床检验中的应用。

聚合酶链反应技术在β－地中海贫血基因诊断中的应用

从云南省德宏州、西双版纳州、玉溪地区和昆明地区采集临床诊断为β－地中海贫血的病例２４例，经提取ＤＮＡ，聚合酶链反应和非同位素（加强化学发光，ＥＣＬ）标记寡核苷酸探针点杂交进行基因诊断。文献报道β－地中海贫血的基因突变主要有十种类型。本组在已完成杂文的病例中最常见的突变为Ｃｏｄｏｎｓ４１－４２，即编码子４１－４２发生框架位移，减少ＴＴＣＴ四个碱基，这与国内广东、四川的研究相似。

16S-23S rDNA内转录间隔区序列寡核苷酸探针鉴定分支杆菌菌种的研究

目的 研究以16S-23S rDNA 内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为靶基因设计分支杆菌菌种寡核苷酸探针,应用PCR-反向杂交技术快速鉴定分支杆菌菌种。方法 应用PCR-反向杂交技术检测26种36株分支杆菌标准株,24株分支杆菌临床分离株。结果 分支杆菌标准株和临床分离株经PCR扩增,依菌种不同可见一条约340bp-450bp范围DNA片段。探针特异性试验表明,21种寡核苷酸探针除草分支杆菌探针。MPH与微黄分支杆菌亦杂交外,其余探针均为特异的。5株结核分支杆菌临床分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,19株非结核分支杆菌临床分离株鉴定至种水平。结论 16S-23S rDNA ITS PCR-反向杂交鉴定分支杆菌菌种简便、快速、准确,具有较高应用价值。

聚合酶链反应产物特异性的阳性证实

以聚合酶链反应(PCR)法在mRNA水平检测T淋巴细胞受体α链可变区基因表达为例,介绍用^(32)P标记的人工合成寡核苷酸探针对PCR产物特异性作阳性证实的方法。该法以干琼脂糖凝胶作为支持物、相对较为简便和省财。用Ca探针以干凝胶作支持物的杂交结果,证实29个Vα基因的PCR扩增中物均为特异性的,放射自显影的带型与位置和溴乙锭染色所示完全吻合。

应用聚合酶链反应-寡核苷酸探针快速检测结核菌耐药基因突变

目的 应用聚合酶链反应 (PCR) 寡核苷酸探针快速检测结核菌耐药基因突变,建立一种新的分子药敏试验方法。方法 以传统药敏试验、PCR 单链构象多态性和PCR 直接测序方法为对照,对利福平、链霉素(SM)和乙胺丁醇耐药的结核菌基因rpoB、rpsL、rrs和embB的寡核苷酸探针,通过反向斑点杂交检测 78株结核菌临床分离株PCR产物。结果 18株结核菌药物敏感株的 4种耐药基因均为野生型。60株结核菌耐药分离株中, 59株为耐RFP株,rpoB基因突变率为 93. 2%,最常见的突变位点为 531位和 526位密码子, 33株为耐SM株,rpsL基因突变率为 75. 8%,均为 43位密码子AAG→AGG突变,rrs基因突变率为 9 .1%,均为 513位A→C突变,rpsL和rrs基因总突变率为 84 .8%; 43株为耐EMB株,embB基因突变率为 58 .1%,均为 306位密码子突变。结论 应用PCR 寡核苷酸探针反向斑点杂交技术可简便、快速、准确地分析大多数结核菌耐药基因突变,检测其耐药性。

聚合酶链反应-寡核苷酸探针检测结核菌耐药基因的临床应用

目的探讨聚合酶链反应（PCR）-寡核苷酸探针检测结核菌耐药基因的临床应用价值。方法耐多药肺结核患者80例分为观察组40例和常规组40例，应用PCR-寡核苷酸探针反向斑点杂交技术测定基因耐药情况和突变类型。结果KatG、inhA、rpoB和embB基因突变率分别为90．9％、84．8％、51．98％和58．1％；寡核苷酸探针膜杂交检测rpoB基因突变的灵敏度为98．0％，特异度为100％，阳性预测值为82．61％，与传统药敏试验的符合率为62．50％；寡核苷酸探针膜杂交检测KatG基因突变的灵敏度为50．56％，特异度为75％，阳性预测值为68．75％，与传统药敏试验的符合率为46．43％；观察组病灶显著吸收、吸收、不变、恶化（32．5％、62．5％、5．0％、0％）均高于常规组（25．O％、50．0％、20．0％、5．0％）（X^2=3．98，X^2=3．92，P〈0．05；X^2=6．78，X^2=6．80，P〈0．01）；观察组治疗后3个月、6个月、9个月痰菌阴转率分别为65．0％、77．5％、85．0％，高于常规组（37．5％、50．0％、60．o％）（X^2=3．86，X^2=3．85，X^2=3．89，均P〈0．05）。结论寡核苷酸探针膜杂交技术一次分析可获得结核菌耐3种药物的4个基因；观察组疗效高于常规组。

自行构建人类白细胞抗原DQA1位点基因分型寡核苷酸芯片性能评价:100例样本与PCR-SSP法的比较

背景:人类白细胞抗原等位基因分型对器官移植和法医鉴定等有重要意义。目前的分型方法难以实现高通量和集成化,准确性和重复性也不理想。目的:比较自行构建的寡核苷酸芯片与序列特异性引物-聚合酶链反应(polymerase chain reaction with sequence-specific primers,PCR-SSP)两种方法用于人类白细胞抗原DQA1基因分型的结果,以评价寡核苷酸芯片的性能。方法:纳入2006-01/2009-03于中国医科大学附属第一医院血液科门诊就诊的患者100例。分别用等位基因特异的PCR-SSP和自行构建的寡核苷酸芯片对患者的人类白细胞抗原DQA1进行分型。寡核苷酸芯片分型采用荧光标记的组间特异性引物扩增基因组DNA,扩增后的产物与分型芯片的探针杂交,由杂交产生的荧光信号确定人类白细胞抗原DQA1位点基因型。比较两种方法分型所获得的结果,不吻合的样本经第三方测序验证。结果与结论:100例临床样本经寡核苷酸芯片和PCR-SSP分型全部成功。分型结果的吻合率为94%。不吻合样本6例,其中4例PCR-SSP定型为杂合子,芯片分型全部为纯合子。经第三方验证,证实芯片的分型全部正确。另外2例不吻合的样本经测序,证实SSP分型错误1例,芯片分型错误1例。芯片的重复率为95%。说明自行构建的寡核苷酸芯片的特异性和灵敏度都能满足基因分型的需要,且稳定性较好。

雄激素受体三螺旋形成寡核苷酸抗前列腺癌细胞增殖的研究

目的 探讨反基因策略对雄激素受体(AR)表达和前列腺癌细胞增殖的影响。方法 针对AR基因2 4 4 7～2 4 6 1核苷酸序列设计并合成三螺旋形成寡核苷酸(TFO) ,经脂质体介导转染LN CaP前列腺癌细胞株,于转染后2 4、4 8、72h分别采用3H 胸腺嘧啶核苷(TdR)参入实验测定癌细胞增殖活性,用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)方法检测ARmRNA表达,用放射配基结合分析法(RBA)单点法检测AR蛋白质表达,并与反义寡核苷酸(ASON)相比较。结果 2 4、4 8、72hTFO组LNCaP细胞的AR表达水平明显低于ASON组(P <0 0 5 ) ,TFO对LNCaP细胞增殖的抑制率显著高于ASON(P <0 0 5 )。结论 该TFO能有效抑制AR表达和前列腺癌细胞增殖。

PCR-ELISA定量检测as-hTERT对HepG2.2.15细胞端粒酶活性的抑制作用

目的 :采用PCR ELISA方法探讨人类端粒酶催化亚单位 (hTERT)基因关键区段的反义寡核苷酸 (as hTERT)对HepG2 .2 .1 5细胞端粒酶活性的抑制作用。方法 :通过PCR合成as hTERT及无关对照序列 ,体外作用于HBVDNA转染的HepG2 .2 .1 5细胞 ,用PCR ELISA定量检测反义核酸作用后的端粒酶活性 ,MTT法观察as hTERT对细胞生长的抑制作用 ,ELISA法检测as hTERT对HBsAg和HBeAg表达的影响。结果 :as hTERT作用浓度为 1 0 μmol/L时 ,定量检测端粒酶活性 ,A450 nm值为 0 .42 ,低于无关序列与生理盐水对照的A450 nm值 (分别为 1 .46、1 .49) ,as hTERT可抑制细胞生长 ,对HBsAg和HBeAg的最佳抑制率分别为 76%和5 6%。结论 :as hTERT在体外可明显降低HepG2 .2 .1 5细胞的端粒酶活性 ,抑制细胞的生长 ,并可影响HBV抗原表达。

EphB4反义寡核苷酸对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的作用

目的观察EphB4反义寡核苷酸(ASODN)对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响,探讨EphB4的生物学功能。方法人工合成EphB4 ASODN,脂质体转染U87细胞。分别应用RT-PCR以及免疫组织化学染色方法检测EphB4 mRNA和蛋白质,评估阻抑效应;并应用MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡;采用Boyden侵袭小室法检测细胞迁移和侵袭力。结果(1)由脂质体转染的EphB4 ASODN对U87细胞EphB4 mRNA和蛋白质表达具有不同程度的抑制作用,且呈现一定的时间-剂量依赖性,600nmol/LASODN作用于U87细胞72h,EphB4 mRNA相对表达量为0.30±0.05,EphB4蛋白表达水平亦明显减弱。(2)各实验组EphB4 ASODN对U87细胞增殖均具有抑制作用,呈明显时间-剂量依赖性;以600nmol/LASODN作用72h,U87细胞生长抑制率达到68.70%,而对照组则无明显抑制作用。(3)EphB4 ASODN诱导U87细胞凋亡呈剂量依赖性。(4)EphB4 ASODN组U87细胞的跨膜数为17.82±2.35,与空白对照组及NSODN组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论EphB4在人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭过程中发挥重要作用,可能成为脑胶质瘤基因治疗的一个新靶点。

TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量一聚合酶链反应（real-timePCR）快速检测方法，为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan—MGB探针，建立并优化real—timePCtt检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价，并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较。结果本研究建立的TaqMan—MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0．2cfu，比普通TaqManreal—timePCR检测限（3—5cfu）提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（R^2=0．999）。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体，结果均为阴性，特异度为100％。结论TaqMan—MGB探针real—timePCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体，有很好的应用前景与价值。

干扰素-γ对感染日本血吸虫小鼠GTP酶表达的影响

目的 探讨干扰素 γ(IFN γ)对小鼠抗日本血吸虫感染保护力的机制。 方法 采用高密度寡核苷酸芯片 (Affymetrix芯片 )结合半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR )方法 ,对BALB/c小鼠感染日本血吸虫过程中脾脏CD4+ T细胞进行基因转录水平分析 ,获得IFN γ诱导鸟苷三磷酸 (GTP)酶家族成员的变化图谱 ;并对其中IFN γ诱导GTP酶 (IGTP)进行分子克隆和序列测定。 结果 小鼠自然感染日本血吸虫过程中 ,IFN γ诱导GTP酶家族成员的基因表达呈现特征性变化 ,感染后 3wk ,基因表达上调或变化不显著 ;感染后 6wk至 13wk ,基因表达持续受到抑制。这种变化特征经RT PCR方法所证实。从小鼠脾脏可扩增出IGTP全长基因 ,但退火温度降低时出现IGTP基因转录缺失。 结论 小鼠急性感染日本血吸虫后 ,体内IFN γ通路逐步受到抑制 ,针对血吸虫感染的依赖IFN

利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒

目的:利用寡核苷酸芯片检测SARS病毒。方法:根据序列Blast比对分析结果,设计逆转录不对称PCR扩增引物和寡核苷酸检测探针。采用Trizol试剂从人静脉血中提取总RNA,经过逆转录和不对称PCR扩增得到的PCR产物与排列有寡核苷酸探针的芯片杂交,杂交后的芯片经激光共聚焦扫描分析。结果:SARS阳性样品与寡核苷酸芯片杂交后出现阳性杂交信号,具有不同二级结构的寡核苷酸探针杂交信号强度不一。结论:寡核苷酸芯片适于快速准确、平行大量地检测SARS病毒。

二聚体蝎型探针快速检测α-地中海贫血基因-α^(3.7)缺失

目的建立快速检测α-地中海贫血基因-α3.7缺失的二聚体蝎型探针荧光聚合酶链反应(gap-PCR)方法。方法采用二聚体蝎型探针gap-PCR技术,建立一种快速检测α-地中海贫血基因-α3.7缺失的方法;检测40份已知基因型和100份临床样本,并与常规gap-PCR法进行平行对比分析。结果本研究建立的检测方法能准确检测α-地中海贫血基因-α3.7缺失;40份已知基因型和100份临床标本检测的灵敏度和准确性均达到100%。结论本研究建立的二聚体蝎型探针α-地中海贫血基因-α3.7缺失gap-PCR方法,操作简单快速,结果准确可靠。

聚合酶链反应结合地高辛标记寡核苷酸杂交检测肠道致病菌的应用

16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列,既保守又相对,呈现出保守区和可变区交错排列的状态.根据这些特点,我们在16S rDNA保守区设计聚合酶链反应（PCR）引物,用一对通用引物在适宜的PCR反应条件下就可以将所有细菌的相应基因片段全部扩增出来,同时利用可变区设计地高辛标记的种特异性寡核苷酸探针与扩增产物进行斑点杂交而区分不同细菌.现报告如下.

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。

多聚酶链反应和寡核苷酸探针检测衣原体

本研究所用引物和探针序列选自衣原体１６Ｓ ｒＲＮＡ基因。以生物素末端标记制备探针。多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增物作琼脂糖凝胶电泳和ＤＮＡ斑点杂交，证实引物为衣原体属特异性。ＰＣＲ检测灵敏度达到相当于１个拷贝的衣原体ＤＮＡ分子。生物素化寡核苷酸探针ＤＮＡ斑点杂交的直接检测灵敏度为１００ｐｇ，结合ＰＣＲ扩增的检测灵敏度为１ｆｇ。本法高度敏感、特异，且方法简便。