基于PCR-DGGE技术分析浓香白酒窖泥梭菌多样性

窖泥是浓香型白酒酿制过程中最主要的微生物源,窖泥中微生物的类型、丰度、新陈代谢活动等均对浓香型白酒品质产生很大的影响。为探究窖泥中梭菌微生物的多样性,利用窖泥理化结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对10个窖泥样品中的梭菌群落及变化规律进行研究。结果表明,所选10个窖泥的理化参数均符合优质窖泥指标要求;在微生物层面,窖泥中检测到的梭菌在属水平上有:嗜碱菌属、丁酸弧菌属、梭菌属、喜热菌属、瘤胃梭菌属、粪球菌属、沉淀杆菌属(Sedimentibacter)、钙原杆菌属(Caldicoprobacter)、温带菌(Tepidimicrobium)、梯氏菌(Tissierella)、孢子菌(Sporanaerobacter)、硫酸盐还原菌属、鲁替孢菌属和梭状芽胞杆菌(Clostridiisalibacter)等,这些菌是优质窖泥的重要指示菌,可知窖泥中含有极其丰富的酿酒功能菌。揭示了可能在白酒酿造中起关键作用的梭菌菌群,在分子水平上为研究浓香型白酒提供了理论依据。

PCR-DGGE技术分析韩式大酱与中式大酱中微生物多样性

微生物在大酱发酵过程中起到至关重要的作用,并与大酱的风味与质量密切相关,因此研究大酱中微生物的多样性有重要意义。该研究选择加工工艺不同的韩式大酱与中式大酱为对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术,通过PCR扩增、切胶回收、PCR测序等分析不同大酱中的微生物多样性。结果表明,大酱中的微生物由于制作工艺的不同存在明显差异。在韩式大酱中,细菌如芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、四联球菌属(Tetragenococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas),真菌如根毛霉属(Rhizomucor)、青霉菌属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、外瓶霉属(Exophiala)、曲霉属(Aspergillus)等分布广泛。在中式大酱中,乳酸菌如片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leucanostoc)、肠杆菌属(Enterobacter),酵母如鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)分布较多。与中式大酱相比,韩式大酱中的真菌种类更丰富。研究结果为进一步探讨传统发酵大酱品质提供了理论依据。

重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其PCR-DGGE分析

国内首次运用FastPrep○R 核酸快速提取系统提取了重金属复合污染农田土壤的DNA ,并对其进行了聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳 (PCR DGGE)分析。结果表明 ,FastPrep○R核酸提取仪与相应的FastD NASPINKitforSoil试剂盒联用时 ,能有效地分离到纯度较高的重金属污染农田土壤的DNA。PCR DGGE电泳图谱表明 ,PCR产物经DGGE检测后得到的电泳条带清晰且分离效果好 ,可以明显反映出重金属复合污染导致了农田土壤微生物在基因上的损伤 ,影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度 ,改变了土壤环境的优势菌群 ,从而使农田土壤微生物群落结构多样性发生变化。可见 ,FastPrep○R核酸提取系统同样适用于重金属污染农田土壤环境中微生物基因组DNA的快速分离和纯化 ,得到的DNA可直接用于PCR DGGE分析。

凡纳滨对虾咸淡水养殖系统内细菌群落组成的PCR-DGGE分析

采用PCR(polym erase chain reaction)-DGGE(denaturing grad ient gel electrophoresis)及传统的微生物培养方法对凡纳滨对虾Litopenaeus vannam ei咸淡水养殖系统内各种环境的细菌群落组成进行了比较研究。传统的微生物培养计数表明,从海湾水、养殖池水到对虾粪样,细菌和弧菌的数量表现出依次增加的趋势,粪样及肠壁中弧菌的数量高出外界水环境1—4个数量级。相对于外界水环境,粪样中有很高的芽孢杆菌孢子含量,但是肠壁定植细菌中不存在芽孢杆菌(孢子)。PCR-DGGE及聚类分析结果表明,从海湾沿岸、养殖池、对虾粪便到对虾肠壁,细菌群落的多样性由高到低,无论是在哪种环境,群落的优势种都十分明显,且只有2—4种。来自同一环境各样品间的细菌群落组成非常相似,来自不同环境的样品,其细菌群落组成差别较大。聚类图上各簇的排列顺序反映了样品在取样空间分布上的毗邻次序和它们的相似程度。

基于PCR-DGGE技术分析生物絮团的细菌群落结构

在草鱼养殖过程中添加碳源(葡萄糖)维持水体C∶N为20∶1以培养生物絮团,通过对生物絮团细菌群落构成进行种类鉴定来评价生物絮团中功能微生物的组成。采用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术分析生物絮团形成第5、10和15天的细菌群落结构。DGGE指纹图谱结果分析表明:第5天和第10天的相似性最高,达67.4%;第5天和第15天相似性系数最低仅为40.5%。第10天时微生物多样性最高,第15天时多样性最低。对DGGE指纹图谱特征条带进行回收、克隆测序,结果表明,生物絮团培养过程主要微生物类群隶属于以下6个纲:α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、拟杆菌纲(Bacteroidetes),其中α-、β-及γ-变形菌占据主要位置。α-proteobacteria为3个阶段的共有优势菌,第5天时特异菌包括食酸菌属(Acidovorax)、气单胞菌属(Aeromonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium),第10天和15天分别为芽孢杆菌属(Bacillus)与红球菌属(Rhodococcus)。研究首次发现,生物絮团应用于淡水养殖系统时细菌的组成和多样性都极其丰富,通过结合分析这些微生物的功能特点,为生物絮团技术在实际养殖生产中的进一步应用奠定基础。

利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性

本文旨在采用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性。选用15羽28日龄肉鸡,按2mL/kgBW喂服枯草芽孢杆菌悬液(109CFU/mL),每天2次,连续3d,34日龄时,利用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法分析肠道菌群的多样性,并对DGGE条带进行回收、测序。结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P<0.05或P<0.01),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为53.2%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PCR-DGGE明显优于ERIC-PCR;回收条带以乳杆菌属细菌为主。结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PCR-DGGE检测方法明显优于ERIC-PCR。

刺参消化道内含物细菌群落组成的PCR-DGGE分析

利用PCR-DGGE技术研究刺参(Apostichopus japonicus)前肠、中肠和后肠内含物的细菌群落组成。通过软件Bio-rad Quantity one分析DGGE指纹图谱,发现刺参后肠内含物的条带数目显著高于前肠和中肠(P=0.003,P=0.016),表明刺参后肠内含物的细菌多样性最高,其次是中肠;前肠内含物的细菌多样性最低。UPGMA聚类分析发现,不同刺参个体其后肠的细菌群落组成差异最小,前肠的细菌群落差异最大。经DGGE分离、条带切割和序列测定,共获得了13条序列,系统发育分析表明,刺参消化道内含物的细菌群落可主要归属于5大类群,即α-变形菌纲(α-proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-proteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidetes)和柔膜菌纲(Mollicutes)。刺参前肠、中肠和后肠内含物的优势菌群均为γ-proteobacteria。Blast分析显示,其中12条与之亲缘关系最近的序列来自从海洋环境中获得的细菌克隆,表明刺参消化道的细菌群落可能直接或间接来源于刺参的栖息地环境。

三种室内饲养鱼类肠道微生物群落PCR-DGGE指纹分析

以室内饲养的斑点叉尾(Ictalurus punctatus)、银鲫和异育银鲫(中科三号)(Carassius auratus gibelio)幼鱼为对象,通过PCR-DGGE指纹技术对其肠道微生物群落进行了探索研究。在三种鱼的肠道中检测到不同的PCR-DGGE指纹谱带,其中斑点叉尾的平均谱带数(7.5)相对于银鲫和异育银鲫的谱带数(分别为15和14)要少。基于PCR-DGGE指纹谱带及各谱带相对丰度的UPGMA聚类和MDS排序结果显示银鲫和异育银鲫肠道微生物相似性高,而与斑点叉尾的差异比较大;rank-abundance散点图及回归分析也显示斑点叉尾与银鲫、异育银鲫肠道微生物群落存在显著差异(P<0.05),而银鲫和异育银鲫之间无显著差异(P=0.383)。在斑点叉尾肠道中检测到的菌群主要是变形杆菌,包括γ-变形杆菌和α-变形杆菌;而银鲫和异育银鲫肠道中菌群主要包括梭杆菌属中的类群,还包括变形杆菌门中的气单胞菌属,以及一些未知的类群。以上结果均表明在所研究的三种鱼的幼鱼阶段,其肠道微生物组成在不同种类鱼中存在差异,且该差异受基因型的影响可能更大。

生物炭对农田土壤细菌群落多样性影响的PCR-DGGE分析

为评价生物炭对农田土壤细菌群落多样性的影响,对不同施肥方式农田土壤细菌总DNA进行提取和16S rDNA特异性扩增,运用变性梯度凝胶电泳DGGE的分子生物学技术,对施肥土壤细菌群落的多样性进行表征。DGGE电泳结果表明,不同处理均可得到20条以上的电泳条带,说明水稻土土壤细菌群落较丰富。从泳道条带数量及光密度值方面对细菌群落多样性指标比较发现,施加生物炭的土壤(T2、T3、T4)细菌丰富度最高,细菌种群较多,其次为秸秆还田处理土壤(T1),而空白对照处理土壤(CK1)细菌群落丰富度最低,各处理之间的细菌种群均匀度指数差异不显著;对细菌群落的条带信息与土壤理化性质进行相关性分析得到,细菌群落的结构变化与各土壤理化性质的相关性大小依次为速效钾>总有机碳>有效磷>全氮>pH。

用PCR-DGGE研究长期施用无机肥对种稻红壤微生物群落多样性的影响

以中国科学院红壤生态试验站的发育于第四纪红粘土的种稻红壤为研究对象，采用PCR-DGGE方法研究了长期施用无机肥对土壤微生物群落多样性的影响。在种植双季稻、连续13a施用不同无机肥后，土壤中细菌、古菌、放线菌和真菌的群落结构发生了较大的变化。未种植水稻的土壤与种稻土壤间四类微生物SSUrDNADGGE带谱相似性只有33％～66％。施磷肥的处理NP、PK、NPK之间微生物群落结构相似性较高，4类微生物的SSUrDNADGGE带谱相似性高达75％～81％。施氮钾肥（NK）、不施肥（CK）处理与施磷肥处理间土壤微生物群落结构的差异较大，其四类微生物的SSUrDNADGGE带谱相似性分别为69％～77％、55％～77％。研究的目的是深入地了解土壤中微生物群落的多样性，为科学施肥、合理利用土壤、保护微生物多样性和实现农业生态系统的可持续发展提供科学依据。

应用PCR-DGGE技术分析黄海冷水团海域的细菌群落组成

利用PCR-DGGE技术对2个季节（2006-04和2006-10）的黄海冷水团海域的细菌群落组成和优势菌群进行了分析.通过软件Glyko Bandscan分析DGGE图谱,4月份所有站位的条带数相近（约17条）,多样性丰富;10月份,在冷水团范围以内站位的条带约16条,其多样性也较丰富;而在冷水团范围以外站位的条带少（约12条）,其多样性较低.细菌16S rDNA V3区特征片段经DGGE分离、条带切割,共得到24条条带,克隆、测序后,进行系统进化分析,结果显示这24条带分别归属于2个细菌类群：变形细菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroides）.在24条序列中有16条分别与变形细菌亚群的γ-和δ-Proteobacteria相似,有5条与拟杆菌门相似.时空分析发现,4月份所有站位水体（海水温度为7-12℃）的细菌群落组成和10月份（冷水团存在期）冷水团内部水体（海水温度低于10℃）的细菌群落组成相同（都包括γ-Proteobacteria、δ-Proteobacteria和Bacteroides）,与10月份冷水团外部水体（海水温度大于19℃）的（包括γ-Proteobacteria和Bacteroides）不同.优势菌群也存在同样的分布特点,4月份所有站位水体的优势菌群与10月份冷水团内部水体的优势菌群也相同（都是γ-Proteobacteria）,而10月份冷水团外部水体不同的站位优势菌群不同.该海域细菌群落组成和优势菌群的分布特点,可能与冷水团的形成有一定的相关性.

PCR-DGGE分析啤酒废水生物处理工艺的微生物区系

应用基于16S rDNA的PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术对啤酒废水'水解酸化+SBR'工艺的微生物多样性进行研究.分别取水解酸化池与SBR池中不同深度以及不同处理时段的活性污泥,提取样品总DNA,通过PCR扩增、变性梯度凝胶电泳,将16SrDNA(V3区)的PCR扩增片段割胶克隆测序确定样品中的微生物群落,与筛选出的高效菌株进行对比分析.结果表明,水解酸化池中的微生物群落随深度的改变,在结构组成和种群数量上均有较大差异,2m深处微生物群落相对丰富,优势条带突出;SBR池不同深度微生物种群结构一致,沉淀期、进水期和曝气期不同处理时段的微生物种类一致,但优势菌群不同;所测序列y2、23、25、31、h5和15号分别与菌株uncultured Thermotogales sp.、Comamonas sp.WTOTU1、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus subtilis、Bdellovibrio bacteriovorus、Comamonas testosteroni有高度同源性,活性污泥样品中的优势条带与高效菌株的序列不同,表明筛选出的高效菌并非为实际处理过程中的优势菌.

PCR-DGGE指纹技术与分离技术结合筛选藏灵菇奶发酵过程的优势菌

目的获得藏灵菇发酵奶发酵过程的优势菌,并开发出纯培养发酵剂替代藏灵菇进行这类新型发酵奶的工业化生产。方法将PCR-DGGE指纹技术和传统培养方法结合,对藏灵菇发酵奶中微生物种群结构进行研究。结果DGGE指纹图谱显示混合菌群中细菌有4条条带无对应的纯菌株,而纯菌株中有2株在混合菌群的图谱上没有相应的条带。通过对150株分离菌的PCR-DGGE指纹图谱分析,获得了8组乳酸菌和5组酵母菌,进一步的序列分析和相似性比较,确立了藏灵菇发酵奶中的优势菌为肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌、开菲尔乳杆菌、干酪乳杆菌和克鲁维酵母,单孢酵母、啤酒酵母、假丝酵母发酵后期成为优势菌。结论本研究建立了一种基于分子生态的微生物高效筛选技术,为藏灵菇纯培养发酵剂的开发提供了理论依据及丰富的菌种资源。

PCR-DGGE分析东北自然发酵酸菜中乳酸菌多样性

为了探明传统的自然发酵白菜中乳酸菌的多样性及其优势乳酸菌群,试验主要采用变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE),对5份采自我国东北地区利用传统方法制作的自然发酵酸菜样品中的乳酸菌多样性进行分析。结果表明,5份传统发酵酸菜样品共鉴定出了9个乳酸菌种,呈现出丰富的多样性。其中,植物乳杆菌、短乳杆菌、清酒乳杆菌和弯曲乳杆菌是酸菜样品的优势菌群,此外,还发现了片球菌、乳酸乳球菌、Hammesii乳杆菌和Odoratitofui乳杆菌,而Hammesii乳杆菌和Odoratitofui乳杆菌在此前文献报道中利用传统方法没有分离到。

PCR-DGGE法研究Sludge bio-membrane(SB)系统中反硝化聚磷菌的变化

采用SB同步脱氮除磷系统富集反硝化聚磷菌,利用平板分离法和PCR-DGGE技术,进行微生物种群的跟踪。研究结果表明:通过平板法分离到的微生物主要为棒状杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌科、莫拉氏菌属、葡萄球菌属、副球菌属共7种,富集后细菌主要为不动杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌科、副球菌属4种,富集后系统内细菌种类减少,与采用Sequencing Batch Reactor(SBR)池富集的反硝化聚磷菌不同。采用PCR-DGGE法发现富集前以黄杆菌属、产碱杆菌属、副球菌属、紫色杆菌属、赤细菌属为主,富集后以产碱杆菌属、副球菌属、紫色杆菌属为主,副球菌属是唯一通过2种办法获得确认的反硝化聚磷菌株。采用PCR-DGGE和16S rDNA克隆文库方法研究的同步反硝化聚磷菌都以变形门占优势。

基于PCR-DGGE的浓香型白酒窖泥细菌群落结构研究

以30,100和200年窖龄窖泥为样品,采用PCR-DGGE技术探索不同窖龄窖泥细菌类群及群落演变规律.结果表明：不同窖泥样品DGGE图谱均出现14-23条较清晰的条带,其中共有优势条带为第4,11,19号,优势度均在2%以上.多样性指数在2.21-2.58之间,且随窖龄的增加而呈现增加趋势;相似性指数在0.427-0.629之间.30年与200年窖泥细菌群落聚为一类,相似性指数最高,达0.629.30年与100年窖泥细菌群落相似性指数最低,为0.427.PCR-DGGE图谱优势条带割胶测序结果显示：它们属于煎盘梭菌、耐乳酸杆菌、梭菌目细菌、Uncultured bacterium、丁酸梭菌、瘤胃球菌属、酪丁酸梭菌、醋酸杆菌属.

用PCR-DGGE研究菌肥对西藏青稞土壤微生物群落多样性的影响

为探讨微生物菌肥对西藏青稞土壤根际微生态的影响,利用传统纯培养与PCR-DGGE(聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳)技术相结合的方法,研究了谷特微生物菌肥不同施用方式和施肥浓度对西藏青稞根区土壤微生物量和细菌群落结构的影响.结果表明,与对照相比,施肥处理显著降低了土壤真菌数量(p<0.05),土壤放线菌数量和微生物量氮含量显著上升(p<0.05).DGGE分析表明,菌肥处理土壤与未施菌肥土壤的细菌群落结构存在明显差异,土壤微生物区系结构发生了改变;DGGE所反映的土壤细菌多样性可以用来判断菌肥发挥作用的程度,合理指导菌肥的施用.本研究中,菌肥的施入促进了土著细菌Acidobacteria、Actinobacteria和Bacillus的生长,抑制了土壤中Blastomonas、Uncultured Rhizobium和Cyanobacterium的生长.两种施肥方式,根施对青稞根区土壤中细菌、真菌和放线菌数量的影响较叶面喷施大,根施对土壤微生物区系的改变较叶面喷施高,根施最佳菌肥施用量为20.0mL/hm2,叶面喷施最佳菌肥施用量为26.7mL/hm2.本研究为准确预测和评价微生物菌肥的施用效果提供了技术参考.

应用PCR-DGGE技术比较绵羊瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃菌群的多样性

本研究采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术结合DGGE图谱条带的克隆和测序比较了绵羊瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃菌群的多样性,同时对菌群进行了聚类分析和主成分分析。结果表明:绵羊瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃内容物DGGE图谱的平均条带数分别为18、13、16和15条;瘤胃和瓣胃内菌群的多样性指数、均匀度和丰富度均较高,分别为2.83、0.79、17.00和2.82、0.79、16.80,而网胃和皱胃内容物较低,分别为2.52、0.70、12.60和2.73、0.76、15.40;聚类分析结果显示不同胃的内容物菌群具有一定差异,但不同动物个体相同胃的内容物相似性系数均高于0.63;PCR-DGGE图谱中测序的条带大多数归为拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes),优势菌群为厚壁菌门(Firmicutes)细菌、拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌、未培养瘤胃细菌(uncultured rumen bacterium)、未培养细菌(uncultured bacterium)和韦荣球菌科(Veillonellaceae)细菌,特异性细菌为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)细菌和瘤胃球菌属(Ruminococcaceae)细菌。结果提示,绵羊4个胃中均含有种类丰富和数量巨大的细菌,且随着消化道部位由前往后的顺序,菌群的多样性呈现先高后降低再升高的趋势。

刺参肠道及养殖池塘菌群组成的PCR-DGGE指纹图谱分析

采用基于16S rDNA的PCR-DGGE指纹图谱技术对黄海北部刺参养殖池塘(底泥、海水)及刺参肠道的菌群组成进行了初步分析。结果显示,从刺参肠道、底泥及海水样品分别获得41、31及41条扩增条带,其中优势条带分别为12、9及10条;三者具20条共有条带,其中4条为各样品的优势条带,共有条带在各样品中的丰度不同;三者分别具5、2及13条特异条带,其中肠道中的第34、42条带以及海水中的第25、46条带丰度均较高;肠道与底泥的菌群组成相似性系数(戴斯系数)为77.8%,二者与海水菌群组成的相似性系数分别为65.9%和55.6%。

PCR-DGGE技术用于石油污染土壤中微生物群落结构多样性的初步研究

采用现代分子生物学技术,结合传统的富集培养过程,直接从土壤中提取细菌总DNA和从培养基富集培养的菌体中提取总DNA,并对基因组总DNA中16S rDNA V3可变区进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定,对油田某区块石油污染土样微生物群落和多样性进行初步研究。结果表明,年代较久的石油重度污染土壤菌群数量少于轻度污染土壤,经人工堆肥处理的土壤生物多样性明显优于未进行人工处理的污染土壤;经堆肥处理的土壤中微生物多样性在纵向上也存在差异,中层土微生物多样性明显,表层土最不明显;不同污染土壤中存在一定数量相同的优势菌群,但也表现了相当的差异性,经堆肥处理的污染土壤中微生物群落组成的相似性在纵向上也存在差异。