PCR-MS HPV检测联合TCT在社区宫颈癌筛查中的应用

目的探讨人乳头状瘤病毒(HPV)基因检测联合宫颈薄层液基细胞学(TCT)在社区宫颈癌筛查中的临床病理意义。方法收集2013年10—12月社区宫颈癌筛查病人资料,以同期本院门诊病人作为对照组,进行两者TCT及宫颈活检结果的统计与比较。结果社区宫颈癌筛查中HPV阳性患者的TCT及宫颈活检阳性检出率明显高于同期本院门诊病人,具有统计学意义。结论 PCR-MS HPV检测具有准确、快速、经济等优点,作为初筛方法,适合在大规模人群的宫颈癌筛查中推广。

微生物饲料添加剂中丁酸梭菌的测定方法比较研究

试验旨在建立快速准确测定微生物饲料添加剂中丁酸梭菌的方法,分别对不同计数培养基和菌株鉴定方法进行比较,并开展实际样品测定。结果显示,丁酸梭菌在亚硫酸铁琼脂、TSC琼脂和TSN琼脂中均可生长,但亚硫酸铁琼脂培养基的计数结果最高;微量生化鉴定管、16S rRNA扩增测序、荧光定量PCR及基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-TOF MS)均能鉴定丁酸梭菌,但荧光定量PCR方法最快速、准确、适用范围广;2批次市售样品分别含丁酸梭菌9.1×10^(8)、1.2×10^(9)CFU/g,典型菌落荧光定量PCR鉴定结果阳性。研究表明,亚硫酸铁琼脂培养基平板计数法结合荧光定量PCR可对微生物饲料添加剂中的丁酸梭菌进行快速有效的测定。

一株发酵乳糖不产气大肠埃希氏菌的分离与鉴定

为了准确鉴定1株分离自餐饮具的大肠埃希氏菌非典型菌株(发酵乳糖不产气),通过传统分离培养、常规生化试验、微生物鉴定、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、多重聚合酶链式反应(multi-PCR)的方法对该菌株进行联合鉴定。结果表明:该菌株乳糖发酵试验及伊红美蓝琼脂(EMB)平板上的菌落形态均有别于典型大肠埃希氏菌,但微生物鉴定、MALDI-TOF MS、多重PCR鉴定结果与标准菌株一致,均显示为大肠埃希氏菌。这说明常规方法检验非典型大肠埃希氏菌有误判风险,建议检验者遇初发酵培养物变浑浊时转接EMB琼脂平板,并辅以微生物自动鉴定仪器或分子生物学方法对可疑菌落进行鉴定,以确保检验结果的准确性。

三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH基因mRNA水平与蜕皮激素浓度变化

甲壳动物的蜕皮过程被认为是由位于眼柄的X器-窦腺复合体(XO-SG)分泌蜕皮抑制激素(MIH)通过调节Y器(YO)合成蜕皮激素而调控的。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)发现MIH基因在三疣梭子蟹眼柄X器-窦腺复合体中表达最强。采用qRT-PCR分析了MIH基因在三疣梭子蟹蜕皮周期中的表达变化,结果表明;A期为(0.42±0.08)倍,B期为(1.09±0.09)倍,C期为(1.35±0.16)倍,D0亚期为(1.00±0.10)倍,D1亚期(0.78±0.07)倍,D2亚期为(0.27±0.08)倍,D3/4亚期为(0.20±0.04)倍。采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-MS/MS)法完成了三疣梭子蟹蜕皮周期中蜕皮激素(20E)浓度变化的测定。A/B期蜕皮激素的浓度较低,低于仪器检测限0.33 pg,C期为(1.666±0.762)ng/mL,D0亚期为(4.047±1.5133)ng/mL,D1亚期为(6.756±4.928)ng/mL,D2亚期为(8.609±3.827)ng/mL,D3亚期为(19.534±4.799)ng/mL,D4亚期为11.616 ng/mL。在三疣梭子蟹蜕皮周期中,MIH基因表达量与血淋巴中蜕皮激素浓度呈现一定拮抗性,揭示MIH抑制Y器合成蜕皮激素而调控着三疣梭子蟹蜕皮的发生和进行。

牛奶过敏原检测方法研究进展

牛奶是八大食物致敏原之一,能引起严重的过敏反应。如何实现食物中牛奶过敏原的快速,准确筛检已成为食品安全领域关注的焦点。牛奶主要过敏原为酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白,其检测方法有电泳法、色谱法、酶联免疫实验(ELISA)、传感器、基于质谱的蛋白质组学(LC-MS/MS)、聚合酶链式反应技术(PCR)等。本文就其检测方法的原理和应用进行综述,旨在为食品中牛奶过敏原的检测提供技术方向,以便保障牛奶过敏患者的安全。

应用多重聚合酶链反应检测鸡毒霉形体和滑液霉形体的研究

根据鸡毒霉形体（ ＭＧ） 、滑液霉形体（ ＭＳ） 的基因文库，设计并合成了分别与ＭＧ、ＭＳ 某段基因序列互补的两对引物，用这两对引物进行多重聚合酶链反应（ ＭｕｌｔｉＰＣＲ） 同时检测ＭＧ 与ＭＳ。当样品中同时含有ＭＧ 和 ＭＳ 的目的模板ＤＮＡ 时，均同时得到２ 条大小与试验设计相符的７３２ ｂｐ（ ＭＧ） 和２０７ ｂｐ （ ＭＳ） 的ＰＣＲ 扩增带；而对其它８ 种禽病病原的扩增均为阴性。敏感性测定结果表明，该多重ＰＣＲ 技术最低能同时检出１００ ｆｇ 的ＭＧ、ＭＳ ＤＮＡ

LRP15基因启动子区甲基化与其表达的关系

为了研究LRP15基因启动子区的甲基化状况及其与基因表达的关系,探讨LRP15基因的甲基化调控机 制,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测LRP15基因启动子区的甲基化状况,应用甲基化抑制剂5-杂 氮-2'-脱氧胞嘧啶(CdR)及去乙酰化酶抑制刑曲古抑菌素(TSA)诱导CpG岛去甲基化及组蛋白乙酰化,观察启动 子区CpG岛甲基化与基因表达的关系。结果显示:白血病细胞系K562中LRP15基因启动子区呈高甲基化状态, 并抑制了该基因的表达。单独应用或联合TSA应用CdR均可去除该基因启动子区的高甲基化状态.并诱导该基 因的表达。这表明LRP15基因的表达受到启动子区甲基化的调控;该基因在K562细胞系中不表达与其启动子区 高甲基化及组蛋白去乙酰化密切相关。结论:甲基转移酶抑制剂与去乙酰化酶抑制剂在白血病治疗中可能具有一 定的价值。

PCR-核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究

背景新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球暴发,实验室检测结果是疾病诊断的重要依据,检测方法的灵敏度和特异度是影响实验结果的关键因素,现实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)核酸检测方法是COVID-19确诊的通用方法,但其检测灵敏度有方法局限性,依赖标本病毒含量。通过对PCR-核酸飞行时间质谱检测方法的优化,从而提高对低新型冠状病毒(SARS-CoV-2)含量病例检测的灵敏度,可为现有方法做有效补充。目的应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)原理,在Clin-ToFⅡ飞行时间质谱系统上,建立PCR-核酸飞行时间质谱(PCR-TOF MS)系统检测SARS-CoV-2的方法,并评估其实际应用价值。方法2020年2—3月于上海市临床检验中心室间质评阳性样本40份、阴性样本7份,国家卫生健康委员会室间质评阳性样本41份、阴性样本33份,本实验室购买阳性质粒及稀释样本32份,健康人样本28份,空白对照超纯水5份,共186份样本作为建立PCR-TOF MS系统数据。于2020年1—2月收集安徽省内临床送检到安徽省疾病预防控制中心的疑似COVID-19患者上呼吸道样本80份(咽拭子样本55份、痰液样本25份)及健康人群样本20份(均为咽拭子样本)作为评估PCR-TOF MS系统效果的数据。建立PCR-TOF MS系统试验体系步骤,包括PCR扩增、虾碱性磷酸酶(SAP)消化、单碱基延伸和质谱检测;并基于阳性质粒优化模版量,根据186份样本检测质谱峰的信噪比(SNP)确定该方法在SARS-CoV-2检测时的判读标准。对80份疑似SARS-CoV-2样本和20份健康人群样本进行检测分析,并与实时荧光定量PCR法进行对比。结果通过对PCR-TOF MS模板条件的优化,模版量6μl时,扩增产物可获得典型的质谱峰图。建立的PCR-TOF MS反应体系可以对SARS-CoV-2核酸的开放读码框1ab(ORF1ab)基因和核壳蛋白(N)基因进行有效扩增检测。本研究PCR-TOF MS方法对临床疑似病例样本的检出率为90.00%,高于实时荧光定量PCR法的75.00%,同时,结果显示,实时荧光定量PCR法检出中含有25.00%的可疑结果,而PCR-TOF MS则无可疑结果。对于痰液和咽拭子两种样本的检出率,PCR-TOF MS法分别为100.00%和85.45%,高于荧光定量PCR法的64.00%和43.64%。阴性样本两种方法均未检出。结论通过PCR技术与飞行时间质谱技术的结合,使得检测SARS-CoV-2目标片段指数级扩大,从而提高样本的检测灵敏度。MALDI-TOF MS技术通过对离子分子量的检测分析,具有较高的准确性和特异性,同时证实了痰液样本优于咽拭子样本。该方法可作为实时荧光定量PCR法的补充和协同,在一定程度上有利于弥补假阴性的问题,从而降低临床漏诊率,提高检测效率,为疫情的研判缩短时间。

甲基化PCR作为白血病微量残留病检测方法的探索

本实验研究探讨以甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)作为白血病微量残留病(MRD)检测方法的可行性。将Id4基因呈完全甲基化的HL-60细胞和Id4基因呈完全非甲基化的Hek937细胞按不同比例混合,实验分为3组:A组为10%HL-60+9%Hek937,B组为1%HL-60+99%Hek937,C组为0.1%HL-60+99.9%Hek937。用MS-PCR方法检测不同白血病细胞比例下Id4基因甲基化情况。结果表明,HL-60细胞仅有155bp的Id4基因甲基化特异性扩增,呈Id4基因完全甲基化;Hek937细胞仅有156bp的Id4基因非甲基化特异性扩增,呈Id4基因完全非甲基化。A、B、C组同时有155bp的Id4基因甲基化和156bp的Id4基因非甲基化特异性扩增,显示Id4基因甲基化表达。结论:MS-PCR方法可从0.1%比例含量的白血病细胞样本中检测到Id4基因甲基化,加之Id4基因甲基化在不同类型白血病中差异不明显,因此用MS-PCR检测Id4基因甲基化状态可以作为一种检测各种类型白血病微量残留病的方法。

无绿藻分子生物学鉴定与分型研究新进展

以基因序列为鉴定基础的分子生物学方法以其客观、可重复性好等优点,被认为是分子鉴定无绿藻的"金标准"。该文对近年来应用在无绿藻鉴定和分型方面的实时定量PCR(Real-Time Quantitative PCR,RT-PCR)技术、单链构象多态性(Single Stranded Conformation Polymophism,SSCP)分析、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分析、高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析、质谱(Mass Spectrometry,MS)分析等分子生物学新技术和新方法进行综述。

结核杆菌含信号肽的Mtb8.4真核表达质粒的构建及鉴定

目的 对结核杆菌新抗原—带信号肽的Mtb8.4(MS)进行基因克隆 ,构建其真核表达质粒并加以鉴定。 方法 采用聚合酶链反应 (PCR)从结核分枝杆菌H 3 7Rv株基因组中扩增出带信号肽的Mtb8.4(MS)目的基因 ,经HindⅢ和EcoRⅠ消化后 ,与 pcDNA3 .1(+ )载体进行连接重组。 结果 pcDNA3 .1(+ ) -MS真核表达质粒构建完成后 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定 ,证实其构建成功。 结论 pcDNA3 .1(+ ) -MS真核表达质粒的成功构建 ,为进一步研究该质粒的免疫保护效果 ,了解信号肽序列在MS蛋白表达和分泌过程中所起的作用及制备相应的结核病DNA疫苗奠定了基础。

MS-PCR法检测血管紧张素原基因M235T多态性

目的 建立新型突变基因分离聚合酶链反应 (MS PCR)法检测血管紧张素原 (AgT)基因M 2 35T多态性 ,以正确评估其与家族性原发性高血压的关系。方法 建立PCR RFLP和MS PCR法最佳实验体系 ,验证敏感性及特异性。结果 ( 1)PCR RFLP体系中 ,随内切酶量和消化时间的增加 ,消化反应越彻底 ,以 0 0 75 μg基因组DNA扩增产物、30UnitTth111 Ⅰ酶消化 3小时为最佳反应体系。 ( 2 )MS PCR法一次扩增即可确定AgT基因型。 ( 3) 10个标本以PCR RFLP法检测者基因型均为MT ,而MS PCR法仅 1例为MT型 ,余 9例均为TT型 ( 90 % )。结论 传统的PCR RFLP可能因消化不彻底而造成结果判断的误差 ;MS PCR以其高敏感性和特异性成为检测基因多态性的快速、简便。

结肠癌细胞系LHX6基因启动子甲基化检测与分析

为探讨结肠癌细胞SW480和HT-29中LHX6基因启动子区CpG岛的甲基化状态,分析去甲基化与结肠癌细胞增殖的关系,用甲基化特异性PCR对SW480和HT-29细胞的LHX6基因启动子区域CpG岛进行检测,对比经5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理后两株细胞该区域甲基化水平之间的差异,用(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑蓝)(MTT)法检测5-Aza-CdR对其增殖的影响,观察5-Aza-CdR对细胞形态的影响.结果表明,SW480与HT-29细胞的LHX6基因启动子区域CpG岛均存在甲基化,分别为41.9%和28.6%;经5-Aza-CdR处理后,SW480甲基化率由41.4%降低到39.7%,HT-29甲基化率由27.4%降低至18.5%(p<0.05);两株细胞的增殖明显被抑制.结肠癌细胞系SW480和HT-29的LHX6基因均存在不同程度的甲基化,研究结果为LHX6可能作为结肠癌肿瘤检测的新分子靶标奠定基础.

海洋石油烃降解菌群构建及其在降解过程中的动态分析

有针对性地选择了实验室从油污染的样品中富集筛选出来的6株细菌构建出一个石油烃降解菌群,采用PCR-DGGE结合平板计数监测法研究了该菌群在石油烃降解过程中的菌群结构变化.结果表明,能产生生物乳化剂的不动杆菌PN3-2在混合菌群中是稳定优势菌,专一性利用烷烃的食烷菌B-5是菌群拥有持久高效降解能力不可缺少的菌株,而降解后期的优势菌铜绿假单胞菌可能对烷烃代谢产物的清除有重要作用.本实验为人工构建有机污染物降解菌群提供了实践经验,并为大规模的生物修复实践奠定了基础.

血管紧张素原基因CD235Met-Thr变异与高血压脑梗塞发病的相关性

探讨汉族人群血管紧张素原(AGT)基因CD235Met-Thr变异与高血压合并脑梗塞发生的关系.采用突变基因分离聚合酶链反应(MS-PCR)方法检测82例高血压合并脑梗塞患者(BI)、67例单纯高血压患者(EH)和95例健康对照者(C)的M235T等位基因型.BI组AGT基因T/T基因型频率和T等位基因频率(分别为0.720和0.811)显著高于C组(分别为0.516和0.700,P<0.05)和EH组(分别为0.537和0.716,P<0.05).结果提示,AGT基因CD235Met-Thr变异增加了汉族人群高血压合并脑梗塞发病的易感性.

副溶血弧菌检测方法研究进展

副溶血弧菌是海产品中常见致病菌,可引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等疾病。由于我国是海产品消费大国,所以必须建立快速、准确、灵敏的方法监测海产品中的副溶血弧菌。目前主要应用分子生物学方法和分析化学方法,从细胞水平和分子水平来检测副溶血弧菌,主要包括实时荧光定量PCR和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF MS),这两种方法可以对副溶血弧菌进行准确定性和定量,是检测食品中副溶血弧菌的快速、特异、灵敏的方法,可用来评估和监管海产品污染副溶血弧菌的风险,保证人们的饮食安全。

肺癌患者PTEN基因启动子高甲基化的检测

目的探讨肺癌患者组织、外周血浆及支气管肺泡灌洗液(BALF)中张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)启动子异常基因化状况及其在肺癌诊断中的价值。方法用甲基化特异性PCR方法检测组织、血浆及BALF中的PTEN基因启动子区CpG岛甲基化。结果45例肺癌患者中,PTEN基因启动子异常甲基化率组织为26.67%(12/45)、血浆为15.56%(7/45),BALF为22.22%(10/45);而非肺癌组织、正常对照血浆、非肺癌患者BALF中未检出甲基化;血浆、BALF中甲基化改变与肿瘤组织甲基化状况显著相关(P<0.01)。结论血浆、BALF中PTEN基因异常甲基化改变的检测在肺癌的早期特异诊断等方面有一定的价值。

一株人血源猪链球菌的分离鉴定与毒力基因检测

目的对北京某医院就诊的一例疑似人感染猪链球菌病患者的血液来源菌株进行鉴定与毒力因子检测分析。方法将患者血液分离菌株接种哥伦比亚血琼脂平板,经革兰氏染色镜检、血清凝集试验、VITEK 2Compact微生物分析仪以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测后,再用PCR技术检测猪链球菌种特异性基因(16S rRNA)和猪链球菌2型特异性荚膜多糖编码基因(cps2J)以及多个毒力基因:溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、溶血素(sly)、细胞外蛋白因子(ef)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、纤粘连蛋白结合蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的编码基因和毒力相关基因orf2。结果传统细菌鉴定方法和蛋白质谱技术以及核酸检测方法将这株患者血源性细菌分离株鉴定为猪链球菌2型,该菌株的毒力基因cps2J、sly、ef、gdh、fbps、gapdh和orf2的PCR检测均为阳性,mrp基因为阴性。结论该株人血源细菌分离株为猪链球菌2型sly+/ef+/mrp强毒株。

花生过敏原检测方法研究进展

花生是重要食物过敏原之一,能引起严重的过敏反应。目前尚没有花生过敏的特效疗法,严格避免食入含花生的食物是花生过敏患者的最佳选择,所以食物中花生的检测就显得尤为重要。本文对花生主要过敏原及其过敏反应研究进展进行简要介绍,重点介绍花生过敏原的主要检测方法的新发展,包括传统的酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫印迹法、聚合酶链式反应(PCR)等,ELISA和免疫印迹法都是应用较为普遍的检验方法,PCR方法应用较少,但它能从DNA/RNA方面检测花生过敏原的存在;新兴检测方法主要包括生物传感器和质谱法,这两种方法在花生检测方面具有可观的前景。未来的这些检测方法将朝着快速、灵敏、简便的方向发展。

霍乱弧菌核酸标准物质定值方法:ICP-MS法和数字PCR法

霍乱弧菌是人类霍乱的病原体,霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行,主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水,死亡率甚高,属于国际检疫传染病。霍乱弧菌定量检测质粒标准物质,霍乱弧菌的外膜蛋白编码基因omp W为靶基因,可作为霍乱弧菌核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒中的阳性物质替代物。构建霍乱弧菌质粒DNA标准样品,采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)方法和数字PCR两种方法定值,最终定值结果为(79. 2±5. 2) ng/μL,可为霍乱弧菌核酸检测的量值准确性、可比性和有效性提供保障。