用cDNA-AFLP银染技术研究与花椰菜花色相关的基因

将 smartc DNA PCR和 AFLP银染技术结合 ,建立了一种新的 m RNA差别显示技术 .用这种方法对花椰菜黄花和白花的两个近等基因系进行了研究 ,找到一条差异带 .经过 Northern点杂交检测 。

PCR-SSCP银染法在检测错配修复基因突变中的应用

目的建立稳定、有效地检测错配修复(Mismatch Repair,MMR)基因突变的方法。方法对30例肠癌及癌旁正常组织标本分别提取DNA,设计错配修复基因hMSH1引物,应用聚合酶链式反应进行PCR扩增,10%聚丙稀酰胺凝胶电泳PCR产物,银染等技术检测分析错配修复基因hMSH1突变;hMSH1抗体为一抗,免疫组化法检测30例肠癌及例癌旁正常组织石蜡切片中hMSH1蛋白的表达。结果30例肠癌组织中发生错配修复基因hMSH1突变4例(发生率13.3%),10例癌旁正常组织中无一例发生错配修复基因hMSH1突变;免疫组化检测到30例肠癌组织中有6例hMSH1蛋白表达阴性,其中hMSH1基因突变的组织hMSH1蛋白均未表达,正常组织中hMSH1蛋白表达正常。结论PCR-SSCP银染法是检测错配修复基因突变的简捷、稳定、有效的方法之一。可成为早期诊断肿瘤发生的分子手段。在肿瘤的早期治疗中具有重要作用。

P^(53)基因PCR-SSCP银染检查痰标本诊断肺癌初步探索(英文)

目的 :为了解痰标本检测肺癌患者 P53 基因突变的可行性及其对临床诊断的意义。材料与方法 :采用改良 Saccomanno法浓缩及保存痰标本 ,部分涂片找癌细胞 ,其余标本进行痰细胞 DNA提取及多聚酶链反应 ( PCR) -单链构象多态性分析 ( SSCP) ,共检测 2 2例病人 ,其中确诊肺癌病人 1 5例 (涂片或活检找到癌细胞 )、临床高度怀疑肺癌病人 5例 (涂片或活检均阴性 )、2例非肿瘤病人 ( 1例为结节病 ,另 1为左中叶肺炎 ) ,同时采用正常肺组织标本作对照。结果 :P53 外显子 6,7,8的 PCR-SSCP银染阳性率在肺癌组及癌疑组分别为 6/ 1 5 (40 % )和 2 / 5 (40 % )。非肿瘤患者痰标本及正常肺组织均未发现 P53基因异常。结论 :改良 Saccomanno法不仅能贮存、浓缩痰细胞 ,而且方便痰标本 DNA提取 ;PCR-SSCP银染方法可用来检测肺癌患者痰细胞的 P53基因突变。

应用PCR-SSCP银染检测膀胱癌中H-ras基因突变

目的 :了解膀胱癌中H ras基因突变情况。方法 :应用PCR SSCP银染和DNA测序技术对 31例膀胱癌组织进行检测。结果 :H ras基因突变发生率为 38 7% ,突变位点在H ras基因的第 1外显子的第 12位密码子 ,由GGC变为GTC。结论 :H ras基因突变与膀胱癌的发生发展存在着一定的联系 ,H ras基因突变可望作为膀胱癌早期临床诊断有价值的指标。

金标银染技术在表达文库筛选中的应用

以胶体金标记钙调素作为探针再辅以银染法 (金标银染技术 ) ,自玉米 c DNA表达文库中筛选钙调素结合蛋白 .该探针保持钙调素的活性 ,特异性地与钙调素结合蛋白相结合 ,在胶体金标记的基础上进行银染 ,灵敏度获得显著提高 (达 ng级 ) .应用这一方法对玉米 c DNA表达文库进行筛选获得了一个与探针特异结合的阳性克隆 .以生物素标记的钙调素对该克隆表达的融合蛋白进行结合实验 ,结果表明该克隆编码的蛋白为一个钙调素结合蛋白 .本文首次报道了以金标银染技术运用于表达文库的筛选并得到阳性克隆 ,这一方法的建立为 c DNA表达文库的筛选提供了简便、快速的方法 .

核仁组成区嗜银染色对腹水涂片中良恶性细胞的鉴别诊断价值

目的 :旨在探讨一种特异性强、敏感性高的良恶性腹水鉴别诊断方法。方法 :腹水患者 75例 ,其中癌性腹水 32例 ,良性腹水 43例。将腹水离心、沉淀、涂片 ,分别行细胞学检查和胶质银染色。胶质银染片行颗粒计数和形态观察。结果 :良性腹水与恶性腹水细胞核Ag-NOR计数存在显著差异 (1.6 4± 0 .2 8,4.5 2± 1.13 ,P<0 .0 1)。恶性腹水细胞核核仁显著增大 ,形态不规则。Ag -NOR计数特异性为 88.37% ,敏感性为71.88% ,其敏感性显著高于细胞学 (31.2 5 % ) (P <0 .0 1)。结论 :胶质银染技术能有效鉴别良恶性腹水 。

应用PCR－SSCP银染法检测结肠癌组织中p53基因突变

应用ＰＣＲ－单链构象多态分析（ＳＳＣＰ）银染技术分析了２１例结肠癌和正常结肠粘膜组织ｐ５３基因第五～第八外显子。发现了９例（４３％）的结肠癌组织出现了反映ｐ５３基因突变的异常条带。结果显示ｐ５３基因的突变与结肠癌的发生和发展有关。应用非同位素的银染方法，能简单、快速检测基因多态性，并避免同位素的危害。

银染检测端粒酶活性方法的建立

目的 应用银染 TRAPEZE技术对消化系肿瘤的端粒酶活性进行初步研究 ,以探讨端粒酶活性与肿瘤的关系 ,建立一个低污染的端粒 DNA显色技术。方法 采用 TRAPEZE-银染方法检测 73例消化道恶性肿瘤组织及 1 7例良性病变组织端粒酶活性。结果采用 χ2检验进行统计学处理。结果 61 /73例消化道恶性肿瘤 ,对照组 2 /1 7例检出端粒酶活性 ;其中食道癌 1 5 /1 7例 ,肠癌 6/9例 ,胃癌 2 0 /2 5例 ,肝癌 2 0 /2 2例检出端粒酶活性 ;高分化癌 1 3/1 7例 ,中分化癌 2 8/31例 ,低分化癌 2 0 /2 5例检出端粒酶活性。 χ2 检验消化道恶性肿瘤及对照组端粒酶活性检出率有显著性差异 ( P<0 .0 0 1 ) ;不同病理组织间及不同分化程度的肿瘤组织间端粒酶活性检出率无显著性差异 ( P>0 .0 5 )。结论 端粒酶活性是消化道恶性肿瘤的一个重要标志 ;端粒酶活性在恶性肿瘤的表达无显著的组织特异性 ,可作为一广谱的肿瘤标志物 ;端粒酶活性与细胞分化程度无明显关系 ;银染技术可以得到理想的端粒 DNA图谱 ,可用于端粒酶活性的检测。

鼻咽癌患者的Smad2/4基因突变分析

利用PCR-SSCP银染技术对30例鼻咽癌患者的Smad2/4基因的所有外显子进行突变分析,以探讨Smad2/4基因与鼻咽癌发病的可能相互关系。结果在所有病例的所有外显子上没有发现任何类型的突变。Smad2/4基因可能不是鼻咽癌的易感基因,TGF-β/Smad2/4信号通路可能不参与鼻咽癌的发病。

结核分枝杆菌耐链霉素与rpsL和rrS基因的相关性研究

为探讨新疆地区结核分枝杆菌对链霉素(streptomycin,STR)产生耐药性的分子机制,建立直接快速检测结核杆菌STR药物敏感性的方法。应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染分析技术,检测62株结核杆菌临床分离株链霉素耐药性及rpsL和rrS基因变异情况,以结核分枝杆菌标准株(H37Rv)为对照。结果发现62株结核杆菌临床分离株中,32株STR敏感株的rpsL和rrS基因未见SSCP泳动异常,30株STR耐药株中,23株(76.7%)中rpsL(21株)和rrS(5株)基因出现SSCP泳动异常,并且3株出现了rpsL和rrS双基因的SSCP泳动异常。因此,rp-sL和rrS基因突变可能是结核分枝杆菌对链霉素产生耐药性的重要分子机制,PCR-SSCP银染技术可作为快速检测结核杆菌STR药物敏感性的方法。

肺癌亚临床诊断标准的研究

目的 探讨痰液 p53基因变异在早期诊断肺癌方面的价值。方法 选择安医大附院呼吸科 1997年 7月至 1997年 10月住院患者 ,其中肺癌 19例 ,男女之比为 16∶ 3,年龄 4 7岁～ 72岁 ,平均年龄 6 1.32岁 ;对照组 (慢性阻塞性肺疾患及肺结核患者 )排除其他系统肿瘤共 2 2例 ,男女之比为 15∶ 7,年龄 4 7岁～ 74岁 ,平均年龄 5 9.4 3岁 ,晨起后清洁口腔 ,连续三天收集痰液于装有固定液 (2 0 ml)的大试管中 ,进行 P53基因 -聚合酶链反应 -单链构象多态性 (P53- PCR- SSCP)分析。结果 肺癌组 9/ 19例痰液中发现 P53基因变异 (P53gene mutations) ,对照组 2 / 2 2例发现 P53基因变异 ,其中一例距临床确诊肺癌提前 3个月 ;对照组与病例组 P53突变率差别有显著性 (X2 =9.0 2 ,P<0 .0 1)肺癌组中 P53基因变异与性别 (P=0 .0 9)、年龄 (P=0 .35 )、吸烟指数 (每日吸烟支数×吸烟年数 ) (P=0 .18)不相关 (以上均为 Fisher确切概率法 )。结论 痰 P53基因检测方法简便、快速 ,经济 ,无创伤性 ,因此 P53基因变异可作为一个有意义的基因标志用于早期诊断肺癌及高危人群筛检。

外周血p53基因检测与大肠癌早期诊断关系

目的分析大肠癌发生过程中p53基因的突变作用,评估外周血p53基因突变分析作为大肠癌高危对象筛查指标的实际应用价值。方法 用聚合酶链反应-单链构象多态(PCR-SSCP)银染技术对50例大肠癌家系成员和20例健康人(对照组)的外周血p53基因第5～8外显子进行检测。结果 大肠癌家系成员和对照组的外周血p53基因突变率为24％和0,差异有显著性(P<0.05)。结论p53基因突变在大肠癌的发生过程中起重要作用,外周血p53基因突变分析可望成为大肠癌高危对象的早期诊断手段。

细胞核仁银染图象的快速阈值分割算法

在细胞核仁银染(AgNORs)图象分析中关键的一步就是通过阈值分割将细胞核和银染颗粒提取出来,以准确地计算出细胞核仁和核的面积、核仁与核的面积之比(I.S％)、核仁与核的积分光密度比值(I.O.D％)等重要参数,为医生进行肿瘤的鉴别诊断提供量化数据。本文提出了一种新的阈值分割算法,采用(红R+绿G+蓝B)/3彩色图象特征作为图象的特征信息,对直方圆数据进行高斯平滑并根据爬山聚类法计算出直方图峰的近似位置、连接相邻两峰以构成一凸多边形并对该凸多边形进行凹性分析,计算出的凸残差最大处就是所要求的阈值T。通过对腺癌细胞和淋巴瘤细胞图象的实际计算,证明该方法是快速有效的。

深圳地区人群苯丙酮尿症患者基因分析

目的 探讨深圳地区苯丙酮尿症 (PKU)患者血苯丙氨酸羟化酶 (phenylalaninehydroxylase ,PAH)基因单核苷酸多态性位点。方法 设计 7对引物 ,应用多聚酶链反应 -单链构像多态 (PCR -SSCP)银染技术和DNA序列分析了 3个PKU家族共 13个成员的PAH基因。结果 PCR -SSCP分析发现 ,其中 2个家族的子女及其父母有电泳条带异常 ,测序结果示两多态性位点均在内含子 10上。结论

人脑胶质瘤PTEN基因变异的研究

目的进一步了解PTEN基因突变和缺失在人脑胶质瘤发生和恶性进展中的作用。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)结合银染技术和双重PCR分别检测10例正常脑组织、10例脑膜瘤、80例胶质瘤PTEN基因第5和第8外显子区域上的突变与缺失情况。结果发现10例正常脑组织和10例良性脑膜瘤均无PTEN基因点突变发生,80例胶质瘤分别有11例(13.75%)和27例(33.75%)发生基因点突变和基因缺失,且PTEN基因失活与星形细胞瘤病理分级明显相关(P<0.05),其中高恶性度胶质瘤(III、IV级)突变率(24.44%)和缺失率(60%)明显高于低恶性度(I、II级)胶质瘤(P<0.05)。结论PTEN基因突变或缺失与胶质瘤病理分级关系密切,可能属于胶质瘤恶性进展的后期事件。

不良孕产夫妇核仁组织区rRNA基因活性的研究

目的 :研究不良孕产夫妇核仁组织区rRNA基因活性的特点。方法 :应用外周血淋巴细胞染色体常规制备方法和Ag -NOR银染技术 ,分析 5 2对不良孕产夫妇及 5 6对正常夫妇染色体标本 ,计数银染NOR数目。结果 :不良孕产夫妇和对照组每个细胞银染NOR均数分别为 7 2 15 0± 0 5 438、6 85 96± 0 5 96 5。统计学分析表明 ,两者有明显差异 (P <0 0 5 )。结论 :不良孕产夫妇NORrRNA基因活性明显增高。NORrRNA基因活性增高可能通过其蛋白产物增高随体联合频率和覆盖着丝粒———动粒复合体而影响染色体的正常分离 。

膀胱癌患者外周血淋巴细胞AgNORs定量测定及临床意义

目的 :探讨膀胱癌患者外周血淋巴细胞AgNORs值的变化及其临床意义。方法 :应用计算机辅助医学图像分析系统测定 3 2例膀胱癌患者的外周血淋巴细胞银染核仁组成区蛋白 (AgNORs)值的变化 ,并与 11例非肿瘤患者进行对照。结果 :膀胱癌患者外周血淋巴细胞AgNORs低于非肿瘤人群 ,其变化与年龄、临床分期、病理分级、治疗手段等有关 ,而与肿瘤的大小无关。结论 :认为外周血淋巴细胞AgNORs的检测可以判断疾病良恶性 ,评价膀胱癌患者的免疫功能 ,指导治疗 ,判断疗效及预后。

p53基因第8外显子在喉癌中的缺失和点突变

目的 探讨抑癌基因 p5 3第 8外显子突变在喉鳞癌分子发病机理中所起的作用。方法 应用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR- SSCP)银染技术和 DNA直接测序法 ,检测喉鳞癌新鲜组织中抑癌基因 p5 3基因第 8外显子的突变情况。结果 6 0例喉鳞癌组织中 ,15例发生迁移率异常的 SSCP区带。在SSCP阳性样本中随机抽出 4例进行测序分析 ,发现两个标本在 2 88位密码子缺失一个 A,两个标本在 2 92位密码子上缺失一个 A。 2 85、2 87密码子上共发生 3次 G→ T的颠换 ,2 86密码子第 3位碱基发生 A→ T的颠换。结论 喉鳞癌 p5 3基因点突变与碱基缺失常常同时并存。 p5 3基因第