贵州荔波瑶族β-地中海贫血筛查及基因分析

目的对贵州省荔波县瑶族(包括白裤瑶、青裤瑶、长衫瑶3个支系)进行β-地中海贫血基因携带者的人群筛查并分析其基因型。方法采用常规血细胞自动生化分析仪检测血红蛋白(Hb)、红细胞计数(RBC)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)等5项血液学指标及抗碱血红蛋白(HbF)和血红蛋白A2(HbA)定量测定对人群进行β-地中海贫血初筛,然后用常规2酚-氯仿抽提法提取β-地中海贫血携带者DNA,再经PCR-反向点杂交法对β珠蛋白进行突变基因分析。结果在受检的586人中(男性280例,女性306例),检出β-地中海贫血携带者26例,其中男性11例,女性15例,检出率为4.437%。经基因分析该地人群的β-地中海贫血基因突变类型主要为CD41-42(TCTT)移码突变1例(3.57%)和CD17(A→T)无义突变6例(21.4%);尚有19例待检测。结论完成对贵州荔波瑶族进行的β-地中海贫血调查,并获取其流行病学资料及基因类型特征,为今后对该地人群进行婚姻指导、产前诊断、提高人口素质具有重要意义。

贵州三都水族β-地中海贫血未知突变的分析

目的用DNA序列测定技术检测贵州省三都地区水族β-地中海贫血的未知突变,了解β-珠蛋白基因在水族人群中的变异情况。方法通过测定红细胞脆性、血红蛋白A2(HbA2)、抗碱血红蛋白(HbF)进行β-地中海贫血血液学筛查;表型分析采用血红蛋白定量;反向点杂交技术用于检测中国人16种已知类型的β-地中海贫血突变;β珠蛋白基因全长DNA测序技术用于未检出突变的标本,确定样品的基因突变及其基因型。结果运用PCR-反向点杂交技术进行基因筛查,发现9例具有典型β-地中海贫血表型特征,但不属于已知的16种β-地中海贫血突变类型。经DNA直接测序分析,发现均有CD2CAC→CAC/CAT、IVS-2nt16C/C→C/G、IVS-2nt74G/G→T/T、lVS-2nt666T/T→T/C4种β-珠蛋白基因多态位点及其组成的基因型,另有2例除了以上4种β-珠蛋白基因多态位点外,还分别发现IVS-1nt14T/T→T/A,第三外显子下游140bpT/T→T/G。结论贵州三都水族β-地中海贫血基因的多样性及其显著的异质性。

多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因高效反义肽核酸序列筛选及其体外抗菌活性观察

目的筛选出能与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA紧密结合的反义肽核酸序列,评估其体外抗菌活性。方法利用Mfold、RNA Structure 4.6两种计算机软件对多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA进行二级结构分析计算,根据最低自由能原则在其mRNA局部杂交松弛区设计反义寡核苷酸,与体外转录的地高辛标记的gyrAmRNA进行斑点杂交,根据杂交信号的强弱筛选出与gyrA mRNA紧密结合的反义寡核苷酸,根据其序列合成肽核酸(pep-tide nucleic acid,PNA),另加设1条与靶序列有6个碱基错配的PNA作为阴性对照,2条PNA分别连接穿膜肽形成肽-肽核酸(peptide-PNA,PPNA)。测定经不同浓度PPNA处理的细菌光密度[D(600)]值并进行平板菌落计数,观察其对细菌生长的抑制作用,采用RT-PCR检测gyrA mRNA的表达水平。结果斑点杂交结果显示,计算机软件设计的10条反义寡核苷酸探针中有5条与gyrA mRNA显示出杂交信号,其中1条信号最强,能够与gyrA mRNA稳定结合,将其以肽-肽核酸的形式合成处理细菌,结果表明其在5μmol/L浓度可完全抑制gyrA mRNA的表达,并抑制鲍曼不动杆菌的生长,在10μmol/L浓度具有杀菌活性,而具有错配碱基的PPNA对细菌生长无明显抑制作用。结论计算机辅助设计联合斑点杂交可在体外模拟体内环境对寡核苷酸与靶基因结合的有效性进行验证,实现在体外高通量筛选高效反义序列。经筛选得到的靶向gyrA基因反义肽-肽核酸可在体外高效抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长。

广东江门地区13725例新生儿遗传性耳聋基因筛查结果分析

目的了解江门地区新生儿常见耳聋基因突变类型和携带率,建立有效的新生儿听力筛查与耳聋基因联合筛查体系。方法选择2016年6月至2018年2月江门市妇幼保健院和开平市妇幼保健院出生的13 725例新生儿,利用诱发耳声发射和自动判别听性脑干电位进行听力筛查,利用PCR反向斑点杂交检测GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体DNA 12S rRNA基因16个突变位点。结果13 725例新生儿听力筛查通过率99.03%(13 592/13 725),未通过率为0.97%(133/13 725),筛查出耳聋基因阳性511例,阳性率为3.72%,其中GJB2基因突变242例(1.76%),SLC26A4基因突变210例(1.53%),线粒体DNA 12S r RNA基因突变29例(0.21%),GJB3基因突变26例(0.19%),发现双基因杂合突变2例,单基因复合杂合突变2例。共检出突变位点14个,检出率最高的为GJB2基因c.235del C突变215例(215/511,42.07%),其次是SLC26A4基因IVS7-2 A>G 137例(137/511,26.81%)。听力筛查联合耳聋基因筛查检测到阳性新生儿630例(4.59%),听力筛查未通过的133例新生儿中耳聋基因检测异常14例,497例新生儿为耳聋基因异常而听力筛查通过。结论江门地区新生儿遗传性耳聋GJB2及SLC26A4基因突变率高,开展新生儿听力筛查联合耳聋基因筛查有助于新生儿耳聋的早期诊断和防治。

地高辛精标记酪氨酸羟化酶RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，Ｄｉｇ）标记的酶氨酸羟化酶（ＴｙｒｏｓｉｎｅＨｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ＴＨ）ＲＮＡ探针，本研究用分子生物学技术重组质粒ＰＧＥＭＴＨＩ，即分别将携带Ｔ７和Ｓｐ６启动子的ＰＧＥＭ－３ｚｆ质粒和携带ＴＨ基因的ＰＫＳＴＨ质粒用限制性内切酶消化并行分离纯化，得到带Ｔ７和ｓｐ６启动子的ＤＮＡ片段和ＴＨ基因片段；经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后转入大肠杆菌，得到ｐＧＥＭＴＨ１重组克隆。经小量提取质粒井用酶切分析检测，证实其确有ＴＨ基因且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化则得到线状ＤＮＡ片段，用Ｔ７ＲＮＡ聚合酶转录合成带有Ｄｉｇ标记的高比活度的单链ＲＮＡ探针；经斑点杂交试验证实该探针具有较高的可靠性。这将为基因治疗帕金森氏病动物模型的疗效检测提供有效手段。

宫颈癌危险因素的流行病学研究

宫颈癌病因复杂，多数研究者认为是多因素综合作用的结果。本文通过病例－对照研究，应用分子及血清流行病学方法，探讨引起宫颈癌的危险因素。应用ＨＰＶ６／１１、ＨＰＶ１６／１８探针，通过斑点分子杂交技术，检测宫颈癌和对照宫颈组织ＤＮＡ中的感染，结果病例组和对照组ＨＰＶ６／１１阳性率分别为２４．６％、２７．５％，差别无显著性，ＨＰｙ１６／１８阳性率分别为４５．６％、９．８％，差别有显著性；应用ＰＣＲ技术检测两组宫颈组织ＤＮＡ中ＨＳＶ－２感染，结果病例组和对照组阳性率分别为２８．１％、７．８％，Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归平衡年龄因素后差别无显著性；应用ＥＬＩＳＡ方法检测血清中ＨＣＭＶ抗体阳性率，结果病例组和对照组ＩｇＭ阳性率分别为１２．３％、５．９％，差别无显著性。用多因素Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归平衡各因素间的作用，最后分析结果表明，文化程度、产次、ＨＰＶ１０／１８感染与宫颈癌的发生有关，其ＯＲ值分别为０．５７、１．８５、３１．９６。