皂荚ISSR-PCR反应体系的建立与优化

建立皂荚ISSR-PCR反应体系,为皂荚遗传多样性分析、种质资源鉴定提供技术支持,以皂荚DNA为模板,对影响PCR扩增反应的4个因素(模板DNA浓度、引物浓度、Master Mix用量、PCR反应循环数)设置6个梯度并从3个水平上进行单因素优化,后采用L 9(34)正交设计,对各处理组合进行电泳检测后进行评分,对评分结果进行极差分析和方差分析,从而筛选出皂荚最佳的ISSR-PCR反应体系和扩增程序以及得出各因素对反应体系的影响程度。通过设置不同的退火温度,利用优化后的皂荚ISSR-PCR反应体系及扩增程序对已公布的100条ISSR通用引物进行筛选。研究结果表明,皂荚ISSR-PCR最佳反应体系为:在25μL的反应体系中,DNA模板浓度35 ng,引物浓度5μmol/L,Master Mix用量12μL,30个循环;各因素影响大小依次是:DNA模板浓度>Master Mix用量>引物浓度>PCR反应循环数。最后在该体系下共筛选出了22条条带清晰、多态性好的引物。

Isolation and Identification Methods for Oral Klebsiella pneumoniae Involved in Onset of Inflammatory Bowel Disease

Purpose: Recently, it was reported that Klebsiella pneumoniae is related to the onset of inflammatory bowel disease including the Crohn disease. It was frequently reported that K. pneumoniae was detected in human oral cavities. Regrettably, it currently remains unclear whether K. pneumoniae is part of the normal oral flora. The aim of this study was to establish the isolation and identification methods for K. pneumoniae from human oral cavities, and investigate its transmission pattern. Methods: A selective medium, OKPSM, for the isolation of K. pneumoniae from oral cavities was developed in this study. Also, PCR primer for the identification and detection at subspecies level of K. pneumoniae was designed. Results: OKPSM and PCR method using the primers designed in this study were useful for the isolation and identification of K. pneumoniae from human oral cavities. K. pneumoniae subsp. pneumoniae was detected at 10.0% in 30 saliva samples. On the other hand, K. pneumoniae subsp. ozaenae and K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis were detected from no sample. Moreover, K. pneumoniae subsp. pneumoniae isolates from same subject at 0 month and after 3 months showed same genotypes on AP-PCR using OPA-07 primer. Conclusion: These results indicated that human oral cavities were not suitable for the habitat of K. pneumoniae.

风信子ISSR-PCR体系的优化及引物筛选

以风信子基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中Mg2+浓度、dNTPs、模板DNA及引物浓度、Taq酶的用量5个因素进行研究,建立了风信子ISSR-PCR扩增最佳反应体系,即:20μL反应体系中分别加入2μL10×Buffer、1.4μL Mg2+(25mmol/L)、1.5μL dNTPs(2.5mmol/L)、1.5μL引物(10pmol/μL),0.2μLTaq酶(5U/μL),1.2μL模板(30ng/μL),ddH2O补足体积。并以此体系对110条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条。

测定猪不同组织基因表达时RT-PCR内参基因的选择

以95kg体重育肥猪的不同组织为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,对SDHA、HMBS、TOP2B、ACTB、B2M、PPIA、GAPDH、HPRT1、RPL4、TBP和YWHAZ共11个候选内参基因表达量进行检测,应用geNorm程序对内参基因的稳定性进行分析。结果表明,肌肉组织中稳定表达的内参基因是TBP、RPL4,心脏组织中稳定表达的内参基因是GAPDH、RPL4,肝脏组织中稳定表达的内参基因是TBP、HPRT1,脾脏组织中稳定表达的内参基因是SDHA、ACTB,肺脏组织中稳定表达的内参基因是B2M、HPRT1,肾脏组织中稳定表达的内参基因是B2M、TBP。由此可见,不同组织中最稳定表达的内参基因不同,不同组织中标准化目的基因的内参基因也不一样。

罗非鱼颗粒蛋白前体cDNA序列与表达分析

颗粒蛋白前体(Progranulin,PGRN)在先天免疫反应调控及个体生长发育过程中均有重要作用。通过对罗非鱼外周血白细胞全长cDNA文库筛选得到的序列进行生物信息学分析,获得罗非鱼Pgrn全长cDNA序列(GenBank登录号为GQ241348)。该cDNA克隆总长843bp,包含一个完整的开放阅读框,编码206个氨基酸,其中推定信号肽20个氨基酸,两个GRN重复单位均56个氨基酸。研究采用实时定量PCR(Real-time RT-PCR)方法对感染海豚链球菌后奥尼罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和吉富罗非鱼4种组织(脑、肝脏、脾脏和头肾)Pgrn mRNA表达情况进行分析。结果显示,Pgrn mRNA在攻毒后4种罗非鱼4种组织中表达均有上调趋势,并且在脾中的表达量最高,提示PGRN在鱼类先天免疫反应调控中起重要作用。另外,奥尼罗非鱼在感染海豚链球菌后6h的脑和肝脏、6h和12h的脾脏和头肾中Pgrn mRNA表达均下调,然后表达升高,这种表达变化在其他三种鱼中不明显,这也许是奥尼罗非鱼抗病力较强的一个原因。研究为从分子水平探讨PGRN在罗非鱼先天免疫反应中的作用机制提供了数据,也为罗非鱼的抗病选育提供了参考分子标记。

温度选择对刺参群体在不同温度下生长及热休克蛋白表达的影响

高温(26℃)培育刺参(Apostichopus japonicus)幼体获得选择群体,生长至1.03 g±1.30 g,与对照组幼参在18、20、22和24℃温度下培育。二者的成活率随着温度升高而降低,而选择组幼参24℃的成活率显著高于对照群体(P<0.05)。不同温度下的特定生长率之间没有差异。TRIzol法提取刺参总RNA,获得刺参HSP70片断基因序列,利用实时定量PCR方法检测,选择群体HSP70mRNA的表达量在正常温度和热激条件下都较对照组高,但表达量升高的倍数相近,选择组为1.99倍,对照组为2.07倍。

鸭茅SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

应用L16（44）正交设计对影响鸭茅SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于鸭茅的SSR反应体系和扩增程序。在15μL体系中各反应的最适合含量为：50ng模板DNA,240μmol/LdNTP,0.4μmol/LSSR引物,1.0UTaqDNA聚合酶,1.5μL10×PCRBuffer,2.5mmol/LMgCl2。PCR适宜扩增程序为：94℃预变性4min,94℃变性30s,52℃复性30s,72℃延伸1min,共35个循环,72℃延伸10min,4℃保存。并对引物最适合退火温度进行优化,最终确定引物退火温度为48～52℃。同时选用100对鸭茅引物对4份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物30对。用于鸭茅SSR标记的进一步研究。

转化的大鼠胚胎成纤维细胞系差异表达基因的筛选研究

来源于转化的大鼠胚胎成纤维细胞系的两株细胞,A1-5细胞与B4细胞相比表现出非常强的抗辐射性并伴随不同寻常强的G2延迟效应;用PCR选择性抑制消减杂交方法对这两株细胞进行差减,希望找到对A1-5细胞表现出的不同寻常的表型起关键作用的某一个或某一些基因。结果得到了160个差减转化子,逐个进行序列测定,并进行Dotblot杂交,共得到35个差异表达基因片段(EST)。通过对美国国家生物技术信息中心(NCBI)的非冗余序列库(NT)、鼠EST库及人EST库的BLAST进行同源检索,发现其中21个代表了尚未登录的新基因,另外14个分别与已知基因高度同源。

主成分回归分析在火炬松早期选择中的应用研究

以19年树龄的火炬松自由授粉家系遗传测试林为研究对象,利用其中6年的生长数据,基于主成分回归(PCR)和遗传相关分析的方法估算火炬松胸径和树高的早期选择树龄,并利用实际数据验证早期选择的准确性。结果显示:(1)19年胸径性状与7年胸径性状的遗传相关系数达到0.83;根据早晚胸径数据建立的回归模型决定系数达到0.847,模型显示7年时胸径数据已经能够解释19年时胸径变异的88.13%;实际数据验证分析显示树龄7年进行胸径的早期选择其准确率可达到83.33%,两种方法均表明树龄7年是火炬松胸径性状早期选择的较好树龄。(2)树高性状早晚遗传相关系数出现无规律变动,难以确定早期选择树龄,而根据早晚树高数据建立的回归模型决定系数仅为0.418,不适宜做早期选择预测,如果以树龄7年或者13年作为树高早期选择年龄,验证分析表明19年树高选择准确率仅为33.33%。表明两种方法在早期选择中结果的一致性。结果表明主成分回归分析(PCR)和遗传相关分析的方法均成功估算到火炬松胸径早期选择树龄为7年,两种方法同时显示该试验材料无法获得树高合适的选择年龄,遗传相关分析结合PCR分析能够互相印证,提高早期选择的准确性,PCR分析还能利用已经建立的模型对无法计算遗传相关系数的一般林分进行优树早期筛选。

小麦糯性基因的多重PCR分子鉴定

采用多重PCR的方法,对其反应条件进行优化,以获得用于小麦糯性(Wx)基因分析的稳定PCR体系。应用两对引物,分别扩增小麦Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因,目的片段大小分别为:230bp/265bp、854bp和204bp。经反复验证,结果准确可靠,重复性好,成本低,可以在同一PCR反应体系中对3个Wx基因进行同时筛选鉴定。该体系可用于Wx蛋白基因的分子标记辅助选择,可以提高小麦淀粉品质评价和糯麦选育的效率。

农杆菌介导多年生黑麦草转化体系的建立

以胚性愈伤组织系,作为转化受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,将报告基因gus和抗除草剂基因bar成功转入多年生黑麦草。共计获得52株T0代抗性植株。利用PCR方法对转基因植株的bar基因进行扩增,确定阳性株系27株。对阳性植株叶片进行GUS染色,有15株叶片呈现较强的蓝色。对再生植株和野生型植株叶片喷施5‰的除草剂Basta溶液,GUS阳性的植株全部表现为Basta抗性。以上结果表明,以黑麦草成熟胚胚性愈伤组织为受体,通过优化农杆菌介导的黑麦草遗传转化体系,初步建立了多年生黑麦草的转基因平台,这对黑麦草的遗传改良具有重要的意义。

利用随机引物对PCR反应条件的筛选及优化试验

不同试验PCR反应的条件是不完全一致的 ,在PCR反应进行前就有必要对反应条件进行筛选和优化 ,因此 ,提出了对关键实验条件的正交筛选 ,结合反应的增强与抑制条件 ,从而筛选出适用于本实验室的最佳反应条件。

PCR-SSCP技术在嗜盐放线菌链单孢菌属快速筛选中的应用

为提高嗜盐放线菌的研究效率,快速、准确的从大量分离菌株中去除重复菌株、筛选出目的菌株,在特异性引物快速定属的基础上,以嗜盐放线菌链单孢菌属的34株菌株为研究对象,采用与PCR相结合的单链构象多态性分析(PCR-SSCP),扩增出16SrRNA基因中的两个高变区,根据结果对34株菌株进行聚类分析,并将其16SrRNA基因片段测序予以验证。结果表明,聚类后34株菌株可大致分为3类,且与16SrRNA基因片段分析结果一致。从而可快速去除重复菌株并反映出菌株间的系统进化关系。同时实验数据可构建成库,使后续分离菌株的筛选工作只需比对数据即可完成,利于提高工作效率,降低实验成本。

一种用少量标本快速构建老年性白内障消减cDNA文库的方法

为从少量标本中获得含较多大片段的、高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用磁珠分离、生物素标记的改良消减杂交法获得差异cDNA ,利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,从而成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .在文库中随机挑取的 2 2个克隆中 ,10 0 0bp以上的片段有 7个 ,占 31 8% ,75 0bp以上有 15个 ,占 6 8 2 % .所得cDNA片段较大 ,可以满足下一步研究需要 .

谷类作物半粒种子的PCR分析及其在标记辅助选择育种中的应用

建立了适于种子DNA分析的快速简便的PCR方法。水稻、小麦和玉米的半粒种子用提取缓冲液处理,产生的提取液可用于PCR和RAPD分析。水稻丰粒种子的DNA和来自叶片的DNA用专一的PCR引物扩增后可以产生同样的PCR产物。含有胚的另半粒种子可以正常发芽。将半粒种子的PCR分析方法用于水稻白叶枯病抗性基因型的鉴定,证明是植物育种和遗传学研究中一种非常实用的方法。

分子标记辅助培育水稻抗白叶枯病和稻瘟病三基因聚合系

水稻的白叶枯病和稻瘟病是水稻的两大主要病害，通过分子标记辅助选择与传统的杂交、自交相结合的方法，将抗稻瘟病的Pi9（t）基因和抗白叶枯病的Xa21及Xa23基因聚合到同一株系中，经多代大田或／和温室接菌鉴定、室内标记选择和田间农艺性状的筛选，获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系L17-L20。用不同国家和地区的20个稻瘟病小种、中国流行的7个白叶枯病菌系c1-c7以及安徽省流行的白叶枯病菌系进行大田或，和温室抗病性鉴定，结果显示，株系L17-L20对20个稻瘟病小种均表现出抗性，抗性水平与Pi9（t）基因的供体亲本75-1-127相当，抗谱相同；对白叶枯病的抗性和抗谱与Xa23基因相似，不论在苗期还是在成株期均抗白叶枯病。与Xa21、Xa23基因的供体亲本M12和CBB23相比，成株期的抗性水平有所增强。利用多重PCR技术，在同一PCR反应中可同时选择Pig（t）和Xa21基因，提高了PCR选择效率。

苦荞SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为了保证SSR-PCR的重复性,快速找到最优的水平组合,采用交互正交设计L27(313)对苦荞SSR-PCR反应体系进行了5因素(Mg2+、dNTP、Taq酶、模板DNA和引物)3水平优化试验,并对148对SSR引物进行了筛选。结果表明:5个单因素和2个交互作用(Mg2+×dNTP、Mg2+×Taq酶)对苦荞SSR-PCR均有极显著影响;最佳反应体系为:20μL总体积,Mg2+1 mmol/L,dNTP 0.3 mmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA30 ng,引物0.25μmol/L,10×buffer 2μL。运用该体系对7份苦荞材料进行扩增,电泳结果显示,扩增条带清晰,重复性好。利用148对SSR引物对滇宁一号、九江苦荞、野苦荞进行扩增,选出具有多态性的引物26对,可用于苦荞遗传多样性分析及遗传图谱构建。

PCR方法检测单核细胞增多性李斯特菌的实验研究

目的建立一种快速、简便、准确,适合于基层应用的检测鉴定Lm的方法。方法选取iap基因作为靶序列设计一对引物,用该引物对4株标准株及4株无关菌进行PCR扩增,得到进一步验证。采用PCR和常规方法同时对人工感染的牛奶进行检测鉴定。结果4株标准株获得了预期700bp左右的扩增片段,而同属的L.welshimeri、L.grayi、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌均没有这一特异性条带。检测人工感染牛奶20份,检出率为90%,高于传统分离培养法(60%)。结论建立的PCR法可用于单增李斯特氏菌的快速、特异、敏感诊断。

抗性选育协同疫苗免疫对鸡羽囊马立克病毒载量的影响

为了研究马立克病(MD)火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗接种和抗性选育对鸡马立克病毒(MDV-1)攻毒后羽囊中病毒载量的影响,选择普通霞烟鸡及其MD抗性品系,利用MDV-1攻毒后第7、14、21、28和35天(DPI)五次采集并分离的全部试验鸡的羽囊为材料,采用Real-time FQ-PCR技术对这些材料中meq基因进行绝对定量分析以确定其病毒载量,用来分析比较MDV-1在MD抗性/普通鸡及HVT疫苗免疫/HVT疫苗未免疫鸡体内的增殖情况。结果显示:1)从MD抗性对病毒载量的影响看,一方面,普通非免疫攻毒组(F组)的MDV-1含量于14、21DPI时显著(P<0.05)高于MD抗性非免疫攻毒组(T组);另一方面,MD抗性免疫攻毒组(R组)的MDV-1含量总体上却和普通免疫攻毒组(G组)相当。2)从HVT疫苗免疫对病毒载量的影响看,一方面,MD抗性非免疫攻毒组(T组)的MDV-1含量于28DPI时显著(P<0.05)高于MD抗性免疫攻毒组(R组);另一方面,普通非免疫攻毒组(F组)的MDV-1含量于14、21DPI时显著(P<0.05)高于普通免疫攻毒组(G组)。3)从MD抗性协同HVT疫苗免疫对病毒载量的影响看,普通非免疫攻毒组(F组)的MDV-1含量于14(P<0.05)、28(P<0.01)、35(P<0.05)DPI时显著高于MD抗性免疫攻毒组(R组)。结果表明,鸡MD抗性选育协同HVT疫苗接种可显著降低鸡羽囊的病毒载量,这将会降低MDV-1传播风险,并提高鸡的存活机会。

二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg^(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg^(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。