PCR直接测序方法及其在肿瘤研究中的应用

ＰＣＲ直接测序技术是ＰＣＲ扩增与核酸测序技术相结合的一种方法。根据此技术的原理，建立了一种以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，α￣（－３５）ＳｄＡＴＰ直接掺入，ＴａｑＤＮＡ聚合酶直接测序ＰＣＲ扩增产物的方法。实验表明：该方法简便、快速、稳定。用此方法对人食管癌组织中的抗癌基因ｐ５３进行了突变测序分析，发现食管癌组织中ｐ５３存在点突变，插入、丢失移码突变。并用此方法对人和恒河猴的ｐ５３内含子序列进行了测定，发现猴第５内含子为８１个核苷酸，第８内含子为９２个核苷酸。

非小细胞肺癌不同组织标本中P16基因的PCR-SSCP分析

目的 :研究非小细胞肺癌 (NSCLC)不同来源与病理分期类型的组织标本中P16基因表达的相互关系。方法 :应用PCR -SSCP方法 ,检测 2 8例手术标本、2 1例支气管镜活检及 2 7例恶性胸水NSCLC患者中P16基因的表达。结果 :2 8例Ⅰ期手术标本中 8例P16基因发生改变 (2 8 6 % ) ,其中 5例纯合性缺失 ,3例点突变 ;2 1例支气管镜活检中 ,8例P16基因发生改变 (38 1% ) ,其中 3例纯合性缺失 ,5例点突变 ;2 7例恶性胸水标本中 ,17例P16基因发生改变 (6 3 0 % ) ,其中 16例纯合性缺失 ,1例点突变。恶性胸水患者的P16基因改变率与Ⅰ期手术标本、支气管镜活检相比较 ,有显著性差异 (分别为P <0 0 1、P<0 0 0 5 )。在 76例NSCLC中 ,Ⅰ期患者的P16基因改变率为 30 0 % (9/ 30 ) ,Ⅱ期患者为 5 0 % (2 / 4 ) ,Ⅲ期患者为 5 1 6 % (16 /31) ,Ⅳ期患者为 5 4 5 % (6 / 11)。Ⅰ期患者的P16基因改变率与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者相比较 ,均有显著性差异 (P <0 0 5 )。腺癌患者的P16基因改变率为 4 5 0 % (18/ 4 0 ) ,鳞癌患者为 4 2 3% (11/ 2 6 ) ,而腺鳞癌混合型为 4 0 0 % (4/ 10 ) ,经统计学分析 ,三者无显著性差异。而鳞癌患者的P16基因突变率为 2 3 1% (6 / 2 6 ) ,腺癌患者为 7 5 % (3/ 4 0 ) ,二者有显著性差异 (P <0

甲基化特异PCR 方法对p16肿瘤抑制基因的研究

目的：研究肺癌、结肠癌组织中 p16 肿瘤抑制基因甲基化状态及其临床意义。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法，特异扩增分析甲基化和非甲基化两种状态。结果：p16基因在人胚肺组织处于非甲基化状态；在人肺巨细胞癌细胞系（PLA801-D)呈甲基化状态；在检测的肿瘤标本中，60％ 肺癌组织及 70％ 结肠癌组织出现甲基化状态。结论：p16 基因的甲基化状态是肺癌、结肠癌组织中 p16 基因异常形式之一，有可能成为肿瘤分子诊断的重要标志，MSP 方法有临床普及应用前景。

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。

改良多重实时荧光定量PCR法测定抑癌基因MGMT、p16、CDH13和RASSF1A甲基化在肺癌早期诊断中的作用

目的:建立改良多重实时荧光定量PCR法,检测抑癌基因MGMR、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化,探讨其在肺癌早期诊断中的应用。方法:选取30例病理确诊为肺癌的患者作为肺癌组,30例病理确诊为良性病变的患者作为对照组。建立改良实时荧光定量PCR体系。检测受试者血清MGMT、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化,对比两组基因甲基化阳性率,计算四项基因甲基化单独及联合用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度。结果:肺癌组受试者血清MGMT、p16、CDH13和RASSF1A显著高于对照组(P<0.05);MGMT、p16、CDH13和RASSF1A四项基因甲基化联合检测用于肺癌早期诊断的敏感度和特异度显著高于单项指标检测(P<0.05)。结论:建立了多重实时荧光定量PCR法用于MGMT、p16、CDH13和RASSF1A基因甲基化检测,联合检测用于肺癌早期诊断具有较高的敏感度和特异度。

IDENTIFICATION OF A NEW HUMAN nm23 GENE,nm23-H3b

Nm23 is a kind of effective tumor metastasis suppressor genes which included two types in human:nm23-H1 and nm23-H2. Amino acid identity between nm23-H1 and nm23-H2 was 88%.In this study,using a pair of primers to flank the part of coding sequence of nm 23,the 5'-translated sequence was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from human normal liver genomic DNA.A 375-base pairs clone was charactertzed,which designated pnm23-H3b.The nm23-H3b nucleotide sequence between 40 bp and 70 bp is different from nm23-H1 and nm23-H2,and other sequences have 86%and 90%identical to nm23-H1 and nm23-H2,respectively.Southern blot containing BglⅡ-digested human liver genomic DNA hybridized to the entire nm23-H3b DNA and showed three bands at 10.5,7.9 and 4.0 Kb.These data demonstrate that the third human nm23 exists possibly.Therefore,nm23 may be considered a family of closely related genes.

银染PCR-SSCP分析膀胱癌P^(53)基因突变

为探讨P53基因突变与膀胱癌病理分级和临床分期的关系，应用银染PCR-SSCP技术分析46例膀胱癌石蜡标本中P53基因突变情况，结果显示膀胱癌中P53基因突变率为30．4％，分化不良的Ⅲ级膀胱癌P53基因突变率显著高于Ⅰ、Ⅱ级分化较好者。发生浸润和转移的T3－4期膀胱癌P53基因突变率显著高于Tia－T1期表浅性膀胱癌。提示：P53基因突变是膀胱癌恶性程度的生物学标志之一，可用来评估患者的预后。

大肠癌中抑癌基因p33/ING1 mRNA的表达及意义

目的 了解p33/ING1表达与大肠癌临床病理特征的关系及其可能作用机制。方法 采用逆转录PCR检测 5 2例散发性大肠癌癌组织及正常大肠粘膜中ING1的表达。结果 在大肠癌组织中p33/ING1mRNA表达较正常粘膜明显减弱 ( 30 /5 2 ,5 7.7% ) ,p33/ING1的低表达与肿瘤的Duke’s分期及淋巴结转移显著相关。

肿瘤转移抑制基因-1在食管鳞癌组织及食管癌EC109细胞中的表达及意义

目的探讨肿瘤转移抑制基因-1(TMSG-1)在食管鳞癌(ESCC)组织及食管癌EC109细胞中的表达及意义。方法采用SP免疫组织化学染色法检测136例ESCC及37例正常食管黏膜组织中TMSG-1蛋白的表达情况,分析TMSG-1与ESCC患者临床病理指标的关系;培养人食管癌EC109细胞并用常用化疗药物顺铂(CDDP)干预,同时设对照组,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,半定量RT-PCR法检测细胞TMSG-1的表达情况。结果 TMSG-1在ESCC和正常食管黏膜的阳性率分别为52.2%(71/136)、94.6%(35/37),差异具有统计学意义(P<0.05)。TMSG-1的异常表达与ESCC组织学分级、患者的TNM分期、淋巴结转移情况相关。顺铂干预组EC109细胞的增殖抑制率较对照组显著增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果显示,干预组EC109细胞TMSG-1的mRNA表达明显高于对照组(P<0.01)。结论 TMSG-1的异常表达与ESCC的发展及转移相关,可作为较为理想的肿瘤标志物辅助诊断并指导临床治疗。

REIC基因在胃癌中的表达及其意义

目的:研究REIC基因在胃癌发生发展中的作用。方法:应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测REIC基因在50例胃癌癌灶、癌旁组织中的表达。结果:26例(52%)胃癌组织中REIC基因mRNA的表达明显低于胃癌癌旁组织(P<0.05),且REIC基因的低表达与胃癌组织浸润深度有关。结论:REIC基因的低表达可能在胃癌的发生、发展中起一定作用,可能是一种潜在的抑癌基因。

前列腺癌中E-钙粘素、p16及雌激素受体基因甲基化的检测及其临床意义

目的:研究前列腺病变中E-钙粘素、p16和雌激素受体(ER)基因启动子CpG岛甲基化状况及其与临床资料的关系,探讨基因过甲基化在前列腺癌(PCa)发生发展中的作用及其临床意义。方法:收集石蜡包埋前列腺全切术标本:良性前列腺增生(BPH)13例,高级别前列腺上皮内瘤(HGPIN)10例,有随访记录的PCa 20例。采用甲基化特异性PCR(MSP)技术对E-钙粘素、p16和ER基因CpG岛甲基化进行检测。结果:E-钙粘素、p16和ER基因过甲基化在PCa中的发生率分别为30%、25%和65%。非恶性病变(BPH和HGPIN)很少发生DNA过甲基化。结论:PCa的发生及进展与E-钙粘素、p16和ER基因过甲基化密切相关,检测甲基化状况对HGPIN与PCa的鉴别诊断可能有辅助作用。E-钙粘素和ER基因过甲基化可能提示预后差。

PTEN、p21基因在新疆哈萨克族食管癌中的表达

目的研究PTEN、p21基因在哈萨克族食管癌中的表达。方法采用RT-PCR法检测PTEN、p21基因在48例哈萨克族食管癌组织及远端无癌组织中的表达,并分析其表达与肿瘤分化、TNM分期、临床分期、淋巴结转移的关系。结果 PTEN基因在癌组织和远端无癌组织中的表达阳性率分别为75%、45.8%,癌组织高于远端无癌组织(χ2=8.537,P<0.05);p21基因在癌组织和远端无癌组织中表达的阳性率分别为95.8%、97.9%,差异无统计学意义(χ2=0.344,P>0.05)。PTEN和p21表达与食管癌分化程度、不同浸润深度及有无淋巴结转移均无相关性。结论 PTEN、p21基因可能均不是哈萨克族食管癌的主要致病基因。

NMBzA对猴食管上皮癌基因和多种抑癌基因的作用

应用ＰＣＲ扩增和直接测序方法，分析致癌物甲基苄基亚硝胺（ＮＭＢｚＡ）对猴食管上皮细胞中癌基因Ｈａ－ｒａｓ和多种抑癌基因ｐ５３、Ｒｂ、ＡＰＣ的作用。结果未发现Ｈａ－ｒａｓ第１２密码子突变；给猴灌喂食管上皮ＮＭＢｚＡ２４和４８ｈ，食管上皮有ｐ５３基因突变指纹；灌喂ＮＭＢｚＡ４８ｈ，存在Ｒｂ与ＡＰＣ基因突变指纹；灌喂ＮＭＢｚＡ第５天的猴食管上皮细胞中，ｐ５３、Ｒｂ、ＡＰＣ基因突变指纹消失。实验证实：化学致癌物ＮＭＢｚＡ能引起多种抑癌基因改变，ＮＭＢｚＡ对细胞中抑癌基因的遗传性突变影响可能需要多次作用。这些基因突变指纹与过去报道的部分原发性食管癌中的ｐ５３、Ｒｂ和ＡＰＣＮＭＢｚＡ突变相同。

SHP-1和JAK1基因在初治急性白血病患者中的表达

目的:探讨SHP-1和JAK1基因在初治急性白血病(AL)细胞的转录表达及其与初治AL患者化疗效果的关系。方法:采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测60例初治AL患者骨髓单个核细胞及20例健康人外周血单个核细胞中SHP-1和JAK1 mRNA的表达。结果:60例初治AL患者SHP-1和JAK1的mRNA表达阳性率分别为30%,100%;初治AL患者SHP-1 mRNA表达水平明显低于正常对照组(P<0.001),JAK1 mRNA表达水平较正常对照组略增高,但差异无统计学意义(P=0.180),初治AL患者SHP-1 mRNA阳性组的诱导化疗完全缓解(CR)率为88.9%,阴性患者组CR率为54.8%,差异有统计学意义(P=0.005)。SHP-1与JAK1 mRNA表达呈负相关(P=0.046)。结论:SHP-1可能是白血病潜在的抑制基因,可望作为判断初治急性白血病患者疗效和预后的指标。

人食管鳞癌组织中RIZ1基因表达水平的研究

目的:研究RIZ1基因mRNA及蛋白在人食管鳞癌中的表达。方法:以48例人食管鳞癌组织、相应癌旁及正常组织为研究对象,Real-time PCR法检测RIZ1基因mRNA表达情况;55例癌组织及相应正常组织采用免疫组织化学法检测RIZ1蛋白的表达情况。结果:统计结果显示人食管鳞癌组织中RIZ1 mRNA的表达量显著低于正常食管组织(P<0.01),癌旁组织中的表达量也显著低于正常食管组织(P<0.01),但癌组织与癌旁组织的表达量无显著性差异(P=0.067)。RIZ1蛋白在癌组织中阳性表达率为29.1%(16/55),在正常食管组织中阳性表达率为76.4%(42/55),差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:人食管鳞癌组织中RIZ1基因不仅在mRNA转录水平,而且在蛋白表达水平明显减低。提示RIZ1表达降低可能与食管鳞癌的发生有关,RIZ1在食管鳞癌的发生过程中起到抑制作用。RIZI可能是食管鳞癌的潜在抑制基因。

生长抑制因子1在肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的探讨生长抑制因子ING1(inhibitor of growth1)在肝细胞肝癌(human hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达情况及临床意义。方法采用定量RT-PCR方法,检测86例HCC组织及相应癌旁组织中ING1 m RNA的表达量,分别计算肿瘤组织和癌旁组织的△CT值,来计算△CT癌旁/△CT肿瘤的比值,以2为阈值,分成高表达组和低表达组,分析两组患者的临床资料及生存时间。结果 ING1 m RNA在HCC组织中的表达水平明显低于癌旁肝组织(P<0.05)。高表达组48例,低表达组38例。两组患者的组织分化程度、淋巴结转移、肿瘤TNM分期以及门脉浸润等临床病理因素,差异有统计学意义(P<0.05);年龄、性别、HBV感染、AFP、肿瘤大小及肝硬化等因素,差异无统计学意义(P>0.05)。高表达组和低表达组患者的中位生存时间分别为34.5个月和19.5个月,高表达组明显长于低表达组(P<0.05)。结论 ING1作为抑癌基因可能参与了HCC的发生发展过程,可作为判断HCC预后的重要分子标志。

肺鳞癌中FHIT基因缺失的研究

目的：检测位于人染色体３ｐ１４．２区的ＦＨＩＴ基因在肺鳞癌中的缺失率，探讨ＦＨＩＴ基因在国人肺鳞癌中的作用。方法：收集手术切除２１例肺鳞癌及对应正常肺组织标本，应用ＲＴ－ＰＣＲ及ＤＮＡ测序技术检测ＦＨＩＴ基因的缺失情况。结果：２１例正常肺组织中均有ＦＨＩＴ基因的完整表达，１０例（４７．６％）肺鳞癌标本中检测出ＦＨＩＴ基因ｍＲＮＡ转录本的异常表达，经测序证实为由于ＦＨＩＴ基因多个外显子缺失所致。结论：首次在国人中证实，位于３ｐ１４．２的ＦＨＩＴ基因在肺鳞癌中存在较高的缺失率，提示ＦＨＩＴ基因为候选抑癌基因，在肺鳞癌的发生发展中起重要作用。

膀胱癌组织中ING1mRNA的表达与意义

目的探讨抑癌基因ING1mRNA在膀胱癌组织中的表达及与肿瘤发生发展的关系。方法采用RT-PCR方法检测38例膀胱癌手术患者的癌组织及其周围正常组织中抑癌基因ING1mRNA的表达水平。结果癌周组织中ING1mRNA均阳性表达;32例膀胱癌组织中ING1mRNA的表达较正常组织降低(32/38,84.2%),其中无表达2例;癌组织表达强度与正常组织相比差异显著(P<0.01),其低表达与肿瘤分级、分期及淋巴转移有关。结论ING1mRNA表达在膀胱癌发展过程中可能发挥重要的调节作用。ING1mRNA可能是膀胱癌患者潜在的恶性判断指标及诊断、预后的判断指标。

结直肠癌患者8号染色体微卫星改变的研究

目的 研究结直肠癌 (colorectalcancer,CRC)患者 8号染色体微卫星改变的情况 ,探讨结直肠癌发病的分子机制。方法 应用聚合酶链反应 ( polymerasechainreaction ,PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色方法 ,选取 8号染色体上 4个微卫星位点 ,对 34例结直肠癌患者的癌组织、癌旁组织及其相应正常组织的微卫星改变情况进行检测分析。结果 ① 34例患者中有 14例至少在一个位点发生微卫星改变 ,总检出率为 4 1 18% ,其中D8S135、D8S2 5 5、2 0 5 9%、17 6 5 %及 11 76 %。癌旁组织中未检测到微卫星改变。②发生两个以上位点改变的 10例 ,在有微卫星改变的患者中占 71 4 2 %。结论 在 8号染色体所选位点上存在较高频率的微卫星改变 ,提示可能存在与结直肠癌发病密切相关的基因 。

人肝癌细胞瘤QGY-7703的p53基因及其表达研究

本文利用等位基因分析,PCR-SSCP,RT-PCR/序列分析,Northern印迹,免疫组织化学,Western印迹,免疫沉淀等方法对人肝癌细胞株QGY-7703的p53基因背景进行了研究,发现17号染色体短臂可能存在等位基因缺失,在p53基因的编码序列上没有发现任何突变,但发现其mRNA和蛋白表达水平很低,表明在QGY-7703细胞中p53基因的低水平表达可能同细胞的恶性程度有关。