maspin/PCR2.1表达载体的构建及意义

目的:构建maspin/PCR2.1表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础。方法:PCR扩增maspin基因全长,将表达载体PCR2.1用Hind111+XbaI进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,转染到人肝癌高转移细胞株MHCC-97中进行表达,检测转染前后maspin表达的变化。结果:重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增;提纯、纯化后,用HindIII、XbaI酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到PCR2.1表达载体,并在人肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达。结论:成功构建了maspin/PCR2.1表达载体,能在真核细胞中。

应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体

RNA干扰是近年来生物技术领域新兴的研究热点之一。在作物的研究中,RNA干扰被认为在作物品质改良中具有重要的应用价值,并已在水稻、小麦、玉米等作物中得到成功应用,但在大豆的研究中尚鲜有报道。在研究植物RNA干扰的实验中,构建相应的RNA干扰表达载体是常用手段,但传统构建方法较费时费力。重组PCR是一种利用重叠延伸的方法进行高效和快速的体外基因片段拼接的PCR技术。研究将重组PCR技术应用于构建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干扰表达载体,一方面探索一条更简便、快捷、适应范围更广泛的大豆基因RNA干扰表达载体构建方法,另一方面所构建的载体为进一步研究RNA干扰在大豆脂肪氧化酶改良中的应用奠定了基础。结果显示应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体是可行的,相比与常规方法此方法更简便、快捷、效率更高。

利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究

利用套叠PCR技术将α factor信号肽基因插入pAO815之EcoRⅠ位点,构建成分泌型表达载体pAO815α A.在不改变原克隆位点EcoRⅠ的条件下,借助pAO815之第873位的HindⅢ位点,将pAO815AOX1启动子873 940片段连同α factor信号肽基因序列(246bp)插入pAO815之HindⅢ EcoRⅠ之间,构建成含α factor信号肽基因的分泌型表达载体pAO815α A.

重叠延伸PCR法构建VPS4B基因定点突变真核表达载体

目的构建含液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)基因定点突变的真核表达载体。方法用RT-PCR法从HuH-7细胞中扩增VPS4B基因,并克隆到真核载体pXF3H上。采用重叠延伸PCR定点突变技术,构建K180Q和E235Q两种突变质粒,经DNA测序确证定点突变的结果,再将VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞,western blot检测融合蛋白表达。结果克隆了VPS4基因,构建了真核载体pXF3H-VPS4B,经重叠延伸PCR得到突变体。DNA测序结果显示,编码180位氨基酸的538～540位碱基由AAG突变为CAG;编码235位氨基酸的703～705位碱基由GAA突变为CAA,其他碱基均无突变。VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞可检出HA-VPS4B融合蛋白表达。结论成功构建了VPS4以及K180Q和E235Q两种突变的真核表达载体。

利用重组PCR技术构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体

[目的]构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体。[方法]利用含有GFP基因和Nos终止子的A2GFP质粒和含有普遍适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子(Ptrpc)的pUCATPH质粒,通过重组PCR技术构建Ptrpc-GFP-Nos重组基因,然后插入到农杆菌质粒pCAMBIA 1300的多克隆位点,构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体,并对其进行酶切和测序鉴定。[结果]通过重组PCR技术,仅通过Ptrpc启动子基因扩增、GFP-Nos基因扩增、Ptrpc-GFP-Nos重组基因扩增、1次双酶切、1次连接和转化,就成功地构建了适合真菌ATMT转化的GFP基因的表达载体pCAMBIA 1300-PGN,不需要构建中间载体,并大大简化了连接步骤。该载体经过PCR、酶切和测序鉴定,结构正确,连接准确,序列无误。[结论]该研究为真菌ATMT突变体的构建和快速检测奠定了基础。

重叠延伸PCR技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体

采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒,结果表明成功构建了Y127F、R254F二个突变基因的重组表达载体。

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。

利用套叠PCR技术改造人可溶性TRAILcDNA片段及真核表达载体的构建

利用套叠PCR技术对可溶性TRAIL基因片段(sTRAIL,114aa-281aa)的“KEX2”位点及“ATTTA”位点分别进行改造,并构建真核表达载体;结果表明:成功获得了3种突变基因:sTRAILK、sTRAILA以及sTRAILAK,并成功构建了4种分泌型酵母表达载体:pPICZα-A-sTRAILK,pPICZα-A-sTRAILA,pPICZα-A-sTRAILAK以及pPICZα-A-sTRAIL.

优化PCR条件扩增人IL-10 cDNA及其原核表达载体构建

目的 :探讨PCR扩增人IL 10基因片段的最佳反应条件并构建人IL 10原核表达载体。方法 :运用降落PCR扩增 5 ’端GC含量高的人IL 10基因片段 ,主要对退火温度和热启动等因素进行优化选择 ;载体和PCR产物经拓扑TA克隆技术连接 ,常规方法转化、筛选阳性重组质粒。结果 :PCR反应的最佳退火温度为 68 5℃ ,此时扩增出的DNA片段大小符合预期设想 ,并通过菌落PCR和DNA测序得到证实。结论 :在上述条件下获得的PCR产物纯度高、非特异性产物少 ,成功地构建了人IL 10原核表达载体。并提示降落PCR是一种潜在的一步找到最佳扩增条件的方法。

重叠PCR技术在构建sodAP基因表达载体中的应用

目的应用重叠PCR技术,构建节杆菌DMDC12的Mn-SOD基因sodAP的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法设计两对引物,分别扩增启动子P121和sodAP基因序列,利用重叠PCR技术,将启动子P121与sodAP基因相连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pET-22b(+),构建重组质粒pET-PsodAP,转化E.coliBL21(DE3)进行表达。用SDS-PAGE检测表达产物,光密度定量分析法分析目的蛋白表达量。结果启动子P121和sodAP基因的连接产物经凝胶电泳检测,可见约800bp的目的条带,测序结果与预期相符;重组表达质粒pET-PsodAP经双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得了表达,表达量占菌体总蛋白的19%。结论应用重叠PCR技术,成功构建了sodAP基因的重组表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中获得表达,为Mn-SOD的进一步工业化生产奠定了基础。

登革2型病毒E抗原基因的RT-PCR扩增及表达载体的构建

目的扩增并克隆登革２型病毒Ｅ抗原基因，构建Ｅ抗原基因表达载体。方法应用ＲＴ－ＰＣＲ法、基因克隆和限制性内切酶酶切分析。结果增殖病毒标准株并提取病毒总ＲＮＡ。在登革２型病毒Ｅ抗原基因两侧疏水区内设计一对ＰＣＲ引物。通过ＲＴ－ＰＣＲ，获得１６００ｂｐＥ抗原编码基因全长ＤＮＡ片段，将其克隆至ｐＫＫ２２３－３质粒的ｔａｃ启动子下游构建成Ｅ抗原表达载体。结论为型特异性Ｅ抗原基因的进一步亚克隆和表达奠定基础；为其他型别登革病毒Ｅ抗原基因的同类研究提供借鉴。

玉米C_4型PPDK基因的分段PCR克隆及其表达载体构建

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4植物和景天科酸代谢(CAM)植物光合作用的关键酶,催化形成固定CO2的初始分子受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。玉米的C4型PPDK基因序列较长,难以直接克隆。本研究设计多对引物,首先利用常规PCR扩增PPDK启动子,再利用分段PCR扩增PPDK基因全长编码序列;测序证实克隆序列正确无误,最后利用In-Fusion技术将各个片段定向克隆至载体p CAMBIA-1391Z,成功构建了玉米C4型PPDK基因的植物表达载体。最终为C4型PPDK基因功能研究和C3植物遗传转化提供可用的基因序列,为全长基因的高效克隆及表达载体构建提供参考。

抗菌肽Defensin基因pcr3.1真核表达载体的构建

通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defensin基因的哺乳动物细胞真核表达载体。把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defensin,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建和鉴定。结果表明,以果蝇总DNA为模板扩增出280bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除一个碱基外,其余的完全一致,译成的氨基酸序列相同。对重组质粒pcr3.1/defensin进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。所以,重组质粒pcr3.1/defensin由真核载体pcr3.1和defensin DNA片段组成。且插入的defensin DNA片段与已知序列完全相同。

通过重叠PCR技术构建番茄转录因子THM27植物表达载体

myb转录因子是一类调控类黄酮生物合成途径中多种酶表达的转录调控因子。本研究通过Trizol的方法成功地从番茄叶片中提取了高质量的RNA,利用巢氏PCR技术从番茄中成功克隆了myb转录因子家族成员之一THM27(839bp),将其与CMV35S启动子及其终止序列以重叠PCR的方法组合成CMV35S启动子-THM27-终止子组合元件,并将其构建到双元表达载体pCAMBIA1 302。

蒙古沙冬青AmDREB2.1表达载体构建及其结合活性鉴定

以蒙古沙冬青为试材,以AmDREB 2.1为研究对象,采用构建植物表达载体和叶盘法进行了AmDREB 2.1转烟草研究,采用Gateway和酵母单杂交技术研究了AmDREB 2.1转录因子的结合活性。结果表明:以BamH I和Sac I酶切位点成功构建了pPZP212-AmDREB 2.1表达载体,通过叶盘法获得了T0转AmDREB 2.1烟草株系。成功构建了pDEST22-AmDREB 2.1的酵母单杂交载体,分别转化YH4271-mDRE和YH4271-wDRE 2种酵母菌株,在Trp^-His^-Ade^-三缺培养基(3-AT浓度为0、20mmol·L^(-1))上筛选获得了阳性克隆,检测其β-半乳糖苷酶活性为阳性,显示AmDREB 2.1具有转录因子的结合活性。

融合PCR技术在山羊痘病毒表达载体构建中的应用

为了构建山羊痘病毒表达载体,试验利用融合PCR的方法连接4种组合的3个不同来源的基因片段,插入含有TK基因的载体中,快速构建羊痘病毒表达载体,并转染至BHK-21细胞中进行验证。结果表明:利用融合PCR技术成功融合了P11-7.5-ZSG、P11-7.5-GFP、I1L-7.5-ZSG、I1L-7.5-GFP 4个组合中的3个基因片段,产物长度均在1.2 kb左右,并插入PGEM-TK载体中,构建了4个表达载体,测序结果与理论上100%同源,转染BHK-21细胞可见绿色荧光。说明试验成功构建了4个山羊痘病毒的表达载体。

应用套叠PCR技术构建番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的hpRNA植物表达载体

植物真核翻译起始因子4E(eIF4E)在蛋白质合成的起始中发挥重要作用,参与植物-病毒互作,影响病毒的侵染过程.为了研究eIF4E在植物病毒侵染中的功能,建立了一种快速的套叠PCR新方法,成功构建了番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的hpRNA结构,并将其连接到改造的植物表达载体pBI121上,为利用RNA干扰技术研究番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因在病毒侵染中的作用奠定了基础.

利用转移PCR技术构建玉米SnRK2基因家族表达载体

在构建玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)基因家族表达载体的过程中,因为表达载体可供选择的多克隆位点较少,且有些还与目的基因同源,所以采用转移PCR(T-PCR)扩增技术替代通常的酶切连接方法。为避免错误连接或未连接的第一轮T-PCR中间产物对退火温度不同的第二轮扩增循环产生干扰,本研究对T-PCR接头引物3′-端和5′-端的两段序列及其退火温度、引物、供体质粒和目标质粒模板的浓度,特别是温度循环程序进行设计和筛选,并用扩增构建的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,进行菌液PCR和测序验证。结果表明,在两条引物3′-端序列理论退火温度相差不大的情况下,T-PCR第一轮扩增的退火温度以低于或接近其中较低的理论退火温度为宜。但在两条引物3′-端序列理论退火温度相差较大的情况下,则应高于其中较低的理论退火温度。T-PCR第二轮扩增的退火温度,适当低于两条引物理论退火温度的平均值。按优化的温度循环程序,从供体质粒pMD19-T扩增ZmSnRK2基因家族8个成员的编码序列,并整合到目标载体pHBT95启动子下游特异位点,重组率达60%以上。综上表明,T-PCR对没有适用多克隆位点的载体构建的实用性较强。本研究通过优化的温度循环程序为表达或诱变载体构建提供了一定的理论参考。

一种载体构建的新方法:重组融合PCR法

本研究介绍一种多目的片段一步重组克隆的载体构建的新方法。该方法要求在PCR引物设计时,在第一个目的片段上游引物的5'端和最后一个目的片段下游引物的5'端各设置16bp与线性化目标载体末端同源的序列,再在各目的片段之间的引物上各设计25bp的重叠序列,以便进行融合PCR将多片段扩增成融合片段。此方法将融合片段与线性化骨架载体进行一步重组、转化和重组子鉴定。该方法只要求骨架载体上有一个特异性酶切位点,特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建;该方法还可以引入定点突变,可便捷构建分析启动子功能等需引入定点突变的载体;该构建方法还可以实现多基因的无缝融合构建多顺反子,在构建原核基因表达载体、叶绿体表达载体、线粒体表达载体方面有着明显优势。本研究以水稻胚乳特异性表达载体PGt1-mGFP-pSB130为例,介绍此载体构建方法。