PCSK9干扰慢病毒载体对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的影响

目的观察PCSK9干扰慢病毒载体（LV—PCSK9RNAi—GFP）对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的影响，并探讨其可能机制。方法6周龄雄性ApoE-/-小鼠30只适应性喂养l周后，随机分为对照组和LV-PCSK9RNAi—GFP组，每组15只，其中LV—PCSK9RNAi—GFP组通过尾静脉注射LV-PCSK9RNAi-GFP，每只鼠注射量为4×10’TU。两组小鼠予以高脂喂养，12周后处死动物，采用荧光显微镜观察LV-PCSK9RNAi-GFP转染情况；实时荧光定量PCR和Westernblotting检测动脉粥样硬化病变处PCSK9表达；

VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的构建VEGF基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组(MHCC97-200)、阴性对照组(MHCC97-NEGA)和空白对照组(MHCC97-空白)中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。

慢病毒载体介导RNA干扰抑制Livin对人大肠癌HT-29细胞生物学行为的影响

目的:探讨慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)抑制大肠癌细胞系HT-29细胞Livin基因表达对其生物学行为的影响方法:设计、合成靶向Livin的siRNA,构建pGCSIL-GFP慢病毒载体,采用Real-time PCR和Western blot方法观察对人大肠癌HT-29细胞Livin mRNA及蛋白质表达的抑制;并通过台盼蓝拒染法、原位末端标记法(TUNEL)、流式细胞术及Matrigel穿膜侵袭实验检测细胞增殖、凋亡、细胞周期及细胞侵袭性的变化。结果:重组慢病毒Livin-RNAi-LV1能够有效抑制Livin的表达,使LivinmRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01);Livin沉默能抑制HT-29细胞增殖(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.01),细胞周期重新分布,G_0/G_1期细胞比例升高(P<0.05),S期细胞比例降低(P<0.05),G_2/M期细胞比例降低(P<0.05) HT-29细胞体外侵袭能力也明显减弱(P<0.01)。结论:利用慢病毒载体介导RNA干扰技术沉默Livin基因的表达可以抑制大肠癌HT-29细胞增殖,促进细胞凋亡,使细胞侵袭性减弱。

HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达

目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体,酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞,以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组(NEG-shRNA)、干扰组(shRNA-HSP90β)、过表达NC对照组(NEG-pEZ)及过表达组(pEZ-HSP90β)。通过qRT-PCR与Western blotting分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后,嘌呤霉素最小致死浓度1μg/ml,感染复数200,感染人Saos-2的感染效率达80%,其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%,pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2. 8倍。进一步研究发现,shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低,p EZ-HSP90β组较NEG-p EZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在Saos-2中稳定表达。

慢病毒载体介导RNA干扰抑制大肠癌细胞HT29的酪氨酸激酶受体RON基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)对大肠癌细胞RON基因的干扰效率,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株。方法应用实时聚合酶链反应(PCR)检测大肠癌细胞DLD-1、HCT116、LOVO、RKO、SW480、HT29的RONmRNA表达情况,筛选出表达丰度能满足RNAi的大肠癌靶细胞HT29。根据人RON基因序列,构建4种慢病毒载体质粒pGCSIL/RON-短发夹RNA(shRNA),转染包装细胞293T,获得4种重组慢病毒pGCSIL/RON-shRNA,分别感染HT29细胞。应用实时PCR检测各组HT29细胞RONmRNA表达情况,筛选出RON干扰效率最高的一种shRNA慢病毒载体质粒,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株HT29/RON-shRNA。结果 DLD-1、HCT116、RKO、SW480、HT29细胞RON表达丰度能满足RNAi的需要,选择HT29细胞作为RNAi的靶细胞。阴性对照病毒感染的细胞样品相对正常未感染病毒的细胞目的基因的相对表达水平为(94±5)%,RONshRNA-1靶点病毒感染的细胞为(86±5)%,RONshRNA-2靶点病毒感染的细胞为(67±6)%,RONshRNA-3靶点病毒感染的细胞为(63±6)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞为(30±8)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞的表达水平显著低于其他细胞(P值均<0.01),其对目的基因的沉默效果达到(70±8)%。结论慢病毒介导RNAi能显著抑制大肠癌细胞HT29的RON基因的表达,慢病毒载体介导的RNAi是一种高效的"基因沉默"的手段。

靶向PCSK9基因shRNA慢病毒载体的构建及其对PCSK9基因表达的沉默

目的设计以PCSK9基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对PCSK9基因表达的影响。方法将3条人PCSK9基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pLentilox3.7,与pCDNA3-hPCSK9-FLAG质粒用Lipofectamine2000共转染293细胞,Westernblotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pCre-VSV-G、pLoxp-CMV-R8.91经293细胞包装后,产生的重组慢病毒感染293细胞,48h后转染pCDNA3-hPCSK9-FLAG质粒,Western blotting法检测人PCSK9基因表达的情况。结果经双酶切鉴定,构建了PCSK9 shRNA慢病毒载体pLentilox-hPC-SK9,鉴定出hshRNA-2为最有效的shRNA。重组的慢病毒能明显的抑制人PCSK9的表达。结论慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性的阻断PCSK9的表达,为进一步探讨PCSK9特异性的shRNA治疗脂代谢异常疾病奠定了基础。

小鼠基质金属蛋白酶-9 RNA干扰慢病毒载体在体外的沉默效应

目的探讨构建的小鼠基质金属蛋白酶(MMP)-9 RNA干扰(RNAi)慢病毒载体在体外工具细胞中的沉默效应。方法针对小鼠MMP-9基因序列构建的MMP-9过表达克隆质粒和RNAi慢病毒载体共转染培养良好的工具细胞(293T和NIH3T3细胞),采用实时荧光定量PCR和Western印迹观察RNAi对工具细胞中MMP-9 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果构建的MMP-9 RNAi慢病毒载体能显著降低工具细胞中MMP-9表达量。结论成功构建了能够抑制小鼠MMP-9表达的RNAi慢病毒载体,为在体研究奠定了基础。

猪SBP1基因过表达与干扰重组慢病毒载体的构建及鉴定

【目的】构建硒结合蛋白1基因(SBP1)过表达与干扰重组慢病毒载体,并通过感染猪骨骼肌卫星细胞验证SBP1基因的过表达和沉默效果,为后续揭示SBP1基因调控肌纤维类型转化及猪肉品质的分子机理打下基础。【方法】在对猪SBP1蛋白进行生物信息学分析的基础上,根据GenBank中猪SBP1基因mRNA序列(XM_021089863.1)PCR扩增SBP1基因全长序列,克隆至过表达慢病毒载体pHBLV-CMV上构建SBP1基因过表达重组慢病毒载体;同时针对猪SBP1基因设计3个干扰靶点序列和1个阴性对照序列,分别克隆至干扰慢病毒载体pHBLV-U6上构建SBP1基因干扰重组慢病毒载体。以构建的重组慢病毒载体感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系,并采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测SBP1基因及其蛋白的表达情况。【结果】猪SBP1蛋白分子式为C_(2523)H_(3916)N_(678)O_(727)S_(24),相对分子量为56.14839 kD,理论等电点(pI)为6.40,为稳定的分泌蛋白;存在39个潜在磷酸化位点,包括20个丝氨酸磷酸化位点、6个酪氨酸磷酸化位点及13个苏氨酸磷酸化位点。以构建的SBP1基因过表达与干扰重组慢病毒载体分别感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选2代后,在荧光显微镜下均能观察到绿色荧光。实时荧光定量PCR检测结果表明,过表达组的SBP1基因相对表达量极显著上调32.0倍(P<0.01,下同),干扰组中以shRNA-3的沉默效果达极显著水平,对应的SBP1基因相对表达量下调58.45%;Western blotting检测结果显示,过表达组的SBP1蛋白表达量极显著上调,而shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3干扰组的SBP1蛋白表达量均极显著下调。【结论】基于猪骨骼肌卫星细胞成功构建了猪SBP1基因过表达稳定表达细胞系,同时鉴定出shRNA-3对SBP1基因的沉默效果最佳并获得稳定沉默细胞系,为后续揭示SBP1基因调控猪肉品质的分子机理打下了基础。

人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用p GCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用Brd U法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,Brd U检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。

慢病毒载体在RNA干扰中的应用进展

小分子RNA干扰技术是一种新兴的特异性地阻断某些基因表达的研究手段,在肿瘤、病毒感染,遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体,由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞,容纳大的外源性目的基因片段,免疫反应小等特点,现已成为转移目的基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中,可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。本文将试图对近期慢病毒载体在RNA干扰当中的应用的最新进展进行综述。

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA慢病毒载体。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒。结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒。结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体。

慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中.

鸡斑联蛋白基因的慢病毒干扰载体的构建及筛选

本试验旨在构建4条鸡斑联蛋白(zyxin)基因的RNAi慢病毒载体,对其进行滴度测定,并进行有效干扰靶点的筛选,为以后开展鸡zyxin基因抗球虫机理的研究奠定基础。提取鸡胸腺组织的RNA,反转录,扩增zyxin基因的编码区,并将其克隆到真核表达载体Pex-6上。设计针对zyxin的shRNA序列,应用基因重组技术插入到Lv3慢病毒表达载体中,将lv3-shRNA载体与包装质粒pGag/Pol、pRev、Pvsv-G共转染293T细胞,进行病毒包装。将得到的病毒原液10倍稀释6个梯度,分别转染293T细胞,进行滴度的测定。将构建好的4条慢病毒载体与Pex-6-zyxin真核表达载体共转染293T细胞,运用RT-PCR和Western-blot方法进行有效干扰靶点的筛选。构建4条针对目的基因zyxin的RNAi慢病毒穿梭质粒表达载体CO1、CO2、CO3、CO4和1个阴性对照质粒,经测序鉴定正确;共转染293T细胞包装病毒并浓缩后滴度达1×108 TU·mL-1,适合感染目的细胞,经过筛选,CO3对zyxin在293T细胞中的表达干扰效果最佳。成功构建了zyxin基因RNA干扰慢病毒表达载体,并进行了有效干扰靶点的筛选,为进一步研究zyxin基因的功能奠定了基础。

Jagged1RNA干扰慢病毒载体抑制舌癌Cal-27细胞增殖、侵袭作用的研究

目的:观察Jagged1RNA干扰慢病毒载体抑制舌癌Cal-27细胞增殖、侵袭作用。方法:采用RT-PCR和Western Blot检测Jagged1siRNA对Cal-27细胞Jagged1基因和蛋白表达水平的敲减效果;克隆形成实验检测干扰后细胞群体依赖性和增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期的变化;Tranwell检测RNA干扰后侵袭率变化。结果:KD组较NC组Jagged1基因和蛋白表达受到明显的敲减。KD组细胞克隆形成率明显降低,较NC组下降42.42%。S期细胞比率均明显下调,约62.98%,G1期细胞比率上调,凋亡率明显增高。72hKD细胞生长抑制率为32.50%。Jagged1RNAi慢病毒载体感染后,KD组侵袭率无下降。结论:下调Jagged1基因和蛋白的表达,可使舌癌细胞克隆形成率明显降低、增殖活性降低、S期细胞比率下降、凋亡率升高、成瘤能力下降。

使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点

【目的】筛选高效的foxp3RNA干扰的靶点用于阻断CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因shRNA序列,化学合成法合成4条shRNA序列,构建含foxp3的靶序列的慢病毒载体;构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点。【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒;成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞;在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3%和95.6%的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具，能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞。将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达，它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段。应用慢病毒载体进行转基因动物的制备，转基因的效率将得到显著提高。慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点，它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰。该技术被广泛用于基因功能的研究，在疾病的基因治疗上也具有良好的前景。

miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与表达检测

目的构建携带人miR-221基因的miRNA干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法。方法合成含干扰序列的双链DNA oligo直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,阳性克隆即为目的基因RNA干扰慢病毒载体质粒。再将目的基因与目的载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T细胞,用western bolt法检测其有效敲减靶序列。结果重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscS1576的靶点干扰效果最好。结论本实验成功构建了人miR-221基因的RNA干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列。

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。

绿色荧光蛋白标记SOX9基因慢病毒载体的构建及在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建绿色荧光蛋白标记的SOX9基因慢病毒载体,转染兔骨髓间充质干细胞,观察SOX9基因的表达情况。方法双酶切从GeneArt提供的含SOX9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体,获得含SOX9基因的质粒pLMIG-13GS0345-1,通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的SOX9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP),将Lenti-SOX9-GFP转染兔骨髓间充质干细胞后观察SOX9基因的表达情况。结果测序结果显示质粒pLMIG-13GS0345-1中的插入序列与基因库中SOX9(NM_000346)基因序列完全一致,成功构建Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP转染兔骨髓间充质干细胞后可观察到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP转染目的细胞后可在mRNA及蛋白水平成功表达SOX9。结论本实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带SOX9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体,并在兔骨髓间充质干细胞中成功表达,为下一步研究提供前期实验基础。