携带分子标记的PCV1-2嵌合病毒的构建及其生物学特性的初步分析

为构建携带分子标记的PCV1-2嵌合病毒,本研究通过基因工程技术将V5标签引入PCV2的ORF2末端,以ORF2-V5替换PCV1的ORF2后克隆于pcDNA3.1(+)载体中,构建pcDNA-PCV1-2m-V5。为检验pcDNA-PCV1-2m-V5的体外感染性,将其转染PK-15细胞后,采用IPMA、RT-PCR等技术进行检测,结果显示:pcDNA-PCV1-2m-V5具有感染性。采集已注射pcDNA-PCV1-2m-V5质粒的小鼠血清接种于PK-15细胞,应用细胞试验、PCR技术、IFA、western blot及电镜等试验对嵌合病毒进行鉴定。结果显示:在小鼠体内拯救出PCV1-2m-V5嵌合病毒,且V5标签的引入能够很好地区分嵌合病毒和亲本病毒产生的Cap蛋白。本实验可为PCV2的感染性DNA (iDNA)疫苗研发提供素材和参考。

嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)灭活苗对商品猪免疫保护效力的研究

运用多功能细胞电穿孔仪将本实验室构建的重组pSK-dPCVl-2质粒转染Dulac细胞，传代培养后获得具有稳定感染细胞的重组嵌合型猪圆环病毒PCV1-2。将该重组病毒灭活后与ISA206VG佐剂乳化制成灭活苗，通过免疫效力试验来评价该疫苗的免疫保护效力。将42日龄PCV2母源抗体水平较低的20头商品猪随机分成4组，另外2头作为健康对照组。分2次免疫，通过检测不同时间的间接免疫荧光抗体滴度、中和抗体滴度、平均日增重、攻毒后病毒血症以及解剖后病理变化和组织中的病毒载量等各项指标评价疫苗的免疫保护效果。结果显示：二免后14d，所有免疫组试验猪都表现为PCV2血清学阳性，且中和抗体水平在1／15～1／20。在猪的增重方面，免疫组猪和健康对照组猪的体重都有增加，而攻毒对照组猪的体重没有增加，且3个免疫组和攻毒对照组之间平均日增重差异显著（P〈0．05）。攻毒后21d扑杀试验猪，免疫组猪的淋巴结和各脏器的大体和显微病变都比攻毒对照组轻微。攻毒对照组的淋巴结出现多核巨细胞和嗜酸性粒细胞，且有多量的淋巴细胞缺失，免疫组未见多核巨细胞，淋巴细胞缺失也较少。淋巴结中PCV2病毒载量的log10在攻毒对照组为5．566±0．432，在10^（4.0）、10^（5.0）、10^（6.0）。TCID50·mL^（-1）免疫组分别为4．469±1.023、4．434±0．716、3．521±0．958，其中10^（5.0）、10^（6.0）TCID50·mL^（-1）免疫组与攻毒对照组差异显著（P〈O．05），但是，试验期间各试验组和健康对照组均未观察到明显的类似PMWS的临床症状。断奶仔猪免疫10^（5.0）TCID52·mL^（-1）以上嵌合型猪圆环病毒PCV1-2灭活苗可以有效地抵抗PCV2b／1B／Jiangsu／JingJiang／2012／11／08病毒感染。

PCV1-2m嵌合病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

为确定感染性克隆质粒免疫小鼠拯救获得的病毒量与诱导抗体之间的关系,以选择最佳免疫剂量,本研究建立了一种快速、灵敏的TaqMan荧光定量PCR检测方法。根据pcDNA3.1(+)-PCV1-2m-V5质粒的ORF2和V5标签序列设计特异性引物和探针,并将该质粒作为阳性标准品,优化荧光定量PCR条件后,按10倍倍比稀释,建立标准曲线,进行灵敏性、特异性和稳定性验证;而后,应用该方法对免疫不同质粒浓度的6组小鼠,分别在免疫后1~9周进行病毒血症检测;同时,应用ELISA方法分别对PCV2抗体滴度进行检测。结果表明,试验建立的荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和稳定性,检测范围可达1.29×10^1~1.29×10^9拷贝/μL;病毒血症可持续至第5周,抗体可维持至第8周。通过分析抗体滴度变化与病毒载量消长关系,确定使用200μg作为小鼠的最佳免疫剂量。本试验为感染性克隆质粒进一步在本体动物(猪)体内评估免疫效果奠定基础。

嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)及PCV2 ORF2真核表达质粒对商品猪的免疫保护

应用本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒（PCV1—2）及真核表达质粒pcDNA3．1／V5-His-ORF2作为免疫原免疫母源抗体ELISA效价在0．07～0．60不等的商品猪，9头猪随机分为4组，1组（3头）肌肉注射免疫10^3.5 TCID50的PCV1-2／头，2组（2头）肌肉注射真核表达质粒200μg／头，3组（2头）肌肉注射空载体（pcDNA3．1）200μg／头，4组（2头）不免疫作为攻毒对照组。于免疫后42d，PCV1—2组及真核表达质粒组产生了PCV2抗体。免疫后42d所有组攻毒PCV2和PRRSV，剂量分别为2×10^4.5 TCID50／头和10^6 TCID50／头。攻毒后21d，攻毒对照组猪淋巴结比免疫组显著肿大，免疫组猪血清、淋巴结中PCV2病毒栽量低于对照组，攻毒对照组猪淋巴结中PCV2抗原含量高于免疫组。这些结果表明，嵌合型PCV1-2及真核表达质粒肌肉注射免疫商品猪后，对PCV2感染能产生保护性免疫应答，有可能成为候选疫苗。

嵌合猪圆环病毒的构建

【目的】为了构建猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的嵌合病毒,并为PCV2疫苗研究奠定基础。【方法】以PCV1基因组为骨架,将其衣壳基因替换为PCV2衣壳基因,来构建嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)DNA克隆,将PCV1-2DNA克隆转染PK-15细胞以获得拯救病毒PCV1-2,并测定PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性。【结果】酶切和序列测定显示成功构建出PCV1-2DNA克隆;免疫荧光试验和PCR检测显示成功获得拯救病毒PCV1-2,其效价达到106.0 TCID50/mL以上;一步生长曲线显示PCV1-2在PK-15细胞中的增殖特性与其亲本病毒近似。【结论】成功构建了1种具有较高体外增殖能力的嵌合猪圆环病毒。

疫苗原辅料中猪圆环病毒1型、2型和猪细小病毒PCR检测方法的建立及验证

目的建立疫苗原辅料中猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1,PCV1)、2型(porcine circovirus type 2,PCV2)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法并进行验证。方法根据NCBI公布的PCV1、PCV2和PPV基因序列设计了3对特异性引物,通过优化反应条件,建立起检测疫苗原辅料中PCV1、PCV2和PPV的PCR检测方法,并对方法的重复性、中间精密度、专属性、耐用性和检测限进行了验证。结果PCR反应的退火温度为55℃,特异性引物浓度为10μmol/L。该方法重复性、中间精密度、专属性和耐用性均良好,对PCV1、PCV2、PPV的最低检测限分别为1 pg/μL、100 fg/μL和10 fg/μL。结论PCR检测方法可以有效检测出疫苗原辅料中外源病毒污染情况,能为生产合格的疫苗提供质量保证。