PCV2-VLP和SVV全病毒灭活的组合物对小鼠的免疫原性研究

为评价猪圆环病毒2型病毒样颗粒(PCV2-VLP)和塞内卡病毒(SVV)全病毒灭活组合物的免疫效果。本研究首先通过透射电镜对PCV2-VLP的完整性进行鉴定,结果显示,PCV2-VLP颗粒完整,大小均一,直径为17 nm~20 nm。表明PCV2-VLP完整性良好,可以用于后续研究。然后将PCV2-VLP与SVV全病毒灭活病毒液等体积混合,制备二联组合物。将二联组合物、PCV2-VLP和SVV全病毒灭活病毒液分别以603和卡波姆作为佐剂两次免疫小鼠,并设立对照组。初免后每周采血,通过ELISA检测PCV2特异性抗体水平及IL-4和IFN-γ的分泌水平,通过中和试验检测小鼠血清针对PCV2和SVV的中和抗体。结果显示,相比卡波姆佐剂,二联组合物、PCV2-VLP和SVV全病毒灭活病毒液配合603佐剂免疫均能够诱导小鼠产生更高的特异性抗体及中和抗体。在相同佐剂下,二联组合物免疫小鼠产生的PCV2抗体与PCV2-VLP组相当,产生的SVV中和抗体则高于SVV单独免疫组(p<0.05)。各免疫组小鼠产生的细胞因子含量相当。表明,603佐剂优于卡波姆佐剂;二联组合物可以刺激小鼠产生针对PCV2和SVV的高水平中和抗体,具有良好的免疫原性。本研究首次将PCV2-VLP与SVV全病毒灭活病毒液进行联合免疫,在小鼠上证明具有良好的免疫原性,具有很大的参考价值,为进一步猪的免疫实验提供参考依据。

联合表达PCV2 ORF2和PPV VP2基因病毒样颗粒获得及免疫原性

将包含有完整闼读框架，长1740、705bp的PPVVP2基因、PCV2ORF2基因分别插入真核表达载体pPI-2．EGFP，构建了重组质粒pPi-Z．EGFP．VP2．ORF2。观察由脂质体介导转染重组质粒后的Vero细胞，结果最早在转染后20h左右出现荧光，36h达到高峰；对转染细胞进行电镜检测，结果观察到病毒样颗粒存在。为证实所获病毒样颗粒是否为重组颗粒，将纯化后的病毒样颗粒免疫仔猪，检测其血中T淋巴细胞的动态变化以及血清抗体水平。结果免疫仔猪的CD3＋、CD4＋T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高；CD8＋T淋巴细胞在免疫后7～14d有所下降，之后再升高。抗体检测结果表明，免疫动物血清中有较高水平的PPV、PCV2特异性抗体。结果表明重组质粒pPI-2．EGFP．VP2．ORF2获得成功表达并形成重组病毒样颗粒，且该颗粒具有良好的免疫原性。

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定

为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap(PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35~19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。

猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因共表达对PPV病毒样颗粒形成的影响

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,得到了重组质粒pPI-2.EG-FP.VP2。再以含有PCV2 SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因,进一步将其插入pPI-2.EGFP.VP2中,构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的真核表达载体pPI-2.EG-FP.VP2.ORF2。用脂质体介导法将pPI-2.EGFP.VP2.ORF2 DNA转染Vero细胞,观察绿色荧光蛋白的融合表达,采用ELISA方法检测转染液与PPV、PCV2高免血清的反应特性,同时将转染出现绿色荧光明显的Vero细胞制备电镜样品。结果显示,VP2基因、ORF2基因与绿色荧光蛋白得到融合表达,转染液与PPV、PCV2高免血清具有良好的抗原抗体反应特性,电镜观察到重组病毒样颗粒的形成。

猪圆环病毒2型衣壳蛋白Loops结构及病毒样颗粒制备的研究进展

病毒样颗粒（virus—like particles，VLPs）是某种病毒的1种或几种结构蛋白在体外组装而成，由于VLPs不包含病毒基因组，在宿主细胞q-不能自我复制，因此VLPs在亚单位疫苗应用中具有较高的生物安全性。自猪圆环病毒2型（poreine circovirus type2，PCV2）在世界范围内流行以来，已经给全球养猪业带来巨大经济损失，因此PCV2的致病机理和疫苗研究具有重要现实意义。PCV2Cap蛋白（capsid protein）是病毒唯一的衣壳蛋白，也是主要的免疫原性蛋白，60个Cap蛋白亚基在体外能自行组装成PCV2VLPs，该VLPs因与天然病毒粒子形态相似并保留了病毒完整的构象表位，已经在PCV2组装和侵染机理研究、亚单位疫苗的研发及其相关性系统疾病（PCV2-systemic disease，PCV2-SD）的预防研究中得到广泛应用。本文主要对PCV2Cap蛋白的Loops结构及其VLPs的制备研究进展进行阐述，为PCV2侵染机理与亚单位疫苗的研发等提供参考。

应用高效体积排阻色谱偶联多角度激光散射鉴定猪圆环病毒2型灭活疫苗及病毒样颗粒疫苗抗原

本文旨在建立基于高效体积排阻色谱(high-performance size-exclusion chromatography,HPSEC)偶联多角度激光散射仪(multi-angle laser light scattering,MALLS)的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)疫苗抗原检测方法。以纯化的PCV2灭活病毒及病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)为参照,对4家生产企业的2种PCV2灭活病毒疫苗(a、b)及VLP疫苗(c、d)破乳后进行HPSEC-MALLS检测及分子量分析;结合PCV2抗原检测卡、Western blotting和透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM),鉴定了特征色谱峰;考察了方法的重复性和检测线性。结果表明,两家企业生产的PCV2灭活病毒疫苗破乳液水相经HPSEC分离,在保留时间约13.3 min处出现抗原特征峰;MALLS计算该色谱峰分子量分别为2.61×10^(6)(±4.34%)Da和2.40×10^(6)(±2.51%)Da。两种VLP疫苗也在13.3 min处出现抗原特征峰,分子量分别为2.09×10^(6)(±2.94%)Da和2.88×10^(6)(±11.85%)Da,接近PCV2的理论分子量;同时在保留时间约11.4 min处也出现色谱峰,经检测分子量为4.37×10^(6)(±0.42%)Da,TEM表征显示为VLP二聚体。取疫苗d和PCV2 VLP纯品进行重复检测,抗原色谱峰面积的RSD(n=3)均小于1.5%,重复性好;将PCV2 VLP纯品梯度稀释检测,VLP及其多聚体的色谱峰面积与浓度均呈良好的线性关系,R2分别为0.999及0.997,能够满足定量及多聚体含量分析。该方法有望成为一种准确、高效的PCV2疫苗的体外评价方法,用于质量评价与提升。

VP22短肽融合猪圆环病毒2型重组病毒样颗粒的构建及其鉴定

采用融合PCR方法将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因和人单纯疱疹病毒Ⅰ型病毒(HSV-1)VP22蛋白转导域串联得到Cap-VP22基因,将其插入到杆状病毒转移载体pFastBac Dual构建pFast-Cap-VP22重组转移载体,通过转化含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含Cap-VP22基因的重组穿梭质粒rBac-2Cap-VP22。重组穿梭质粒转染昆虫细胞(Sf9),获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察对表达产物进行检测。结果表明,成功构建含双拷贝Cap-VP22基因的杆状病毒载体,IFA证实重组蛋白在Sf9细胞中获得正确表达,与PCV2阳性血清具有良好的反应原性;电镜观察结果显示细胞上清中的目的蛋白可装配形成直径约17nm的病毒样颗粒(VLPs);表明C端融合VP22蛋白转导域序列并不影响Cap蛋白的组装。本研究为进一步研制安全、高效的PCV2疫苗奠定基础。

Loop EF区嵌合猪细小病毒B细胞表位对猪圆环病毒2型病毒样颗粒组装的影响

Loop EF是猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的重要Loop结构,然而它在PCV2组装过程中的作用仍不清楚。本研究通过模拟PCV2病毒样颗粒(VLPs)3D结构,比较分析PCV2和PCV1、PCV3的氨基酸序列以及预测Loop EF的突变位点,筛选出PCV2 Loop EF中可供外源表位替换或插入的capsid表面位点,即第133位丙氨酸。探索性地针对该位点设计3个突变体,分别为猪细小病毒1型(PPV1)B细胞线性表位(228QQITDA233)插入PCV2 Cap第132和133位氨基酸、第133和134位氨基酸之间及替换第133位氨基酸。利用over-lap PCR等技术构建上述3个突变体的重组质粒,在大肠杆菌(BL21/DE3)中表达,并利用镍柱亲和层析纯化3个突变体蛋白,最后在体外进行VLPs组装,电镜结果显示3个突变体蛋白均可体外组装成完整的VLPs。结果表明,Loop EF中第133位丙氨酸的替换或插入外源表位突变不影响VLPs组装,提示PCV2 VLPs Loop EF展示外源抗原表位具有可行性。

N-末端核定位序列对猪圆环病毒衣壳蛋白病毒样颗粒在汉逊酵母中组装的影响

目的探讨N-末端核定位序列(nuclear localization signal,NLS)对猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)衣壳蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)中组装的影响。方法分别构建表达PCV2 ORF2全长及NLS截短型重组表达质粒p MOXZ-full和p MOXZ-ΔN40,电转至HP,构建重组酵母表达菌株full-HP和ΔN40-HP,获得的两种表达产物经蔗糖密度梯度超速离心及超滤后,Western blot法检测两种表达产物的单体蛋白表达和VLP组装效率,透射电子显微镜观察VLP形态,小鼠免疫试验检测VLP的免疫原性,地高辛标记DNA杂交法检测VLP的DNA结合能力。结果与全长ORF2表达产物PCV2-VLP(full)比较,NLS截短型表达产物PCV2-VLP(ΔN40)的单体表达量略有提高,但VLP组装效率及DNA结合能力均降低。两种VLP颗粒形态相近,直径约20 nm;两种VLP免疫小鼠血清的抗体几何平均滴度(GMT)差异无统计学意义(P>0.05)。结论去除NLS可提高PCV2衣壳蛋白VLP单体的表达水平,但不是VLP组装所必须的,且可使VLP的组装率略有降低。本研究为PCV2-VLP结构和疫苗的研究奠定了基础。