规模化猪场猪圆环病毒3型的检疫及防控

猪圆环病毒3型(porcive circovirus type,PCV3)是近年来发现的一种新型病毒,可对猪群造成严重影响。介绍了PCV3病毒及其危害,并阐述了规模化猪场中PCV3病毒检疫方法,包括血清学检测、RT-PCR和测序技术等,提出了有效防控该病毒的建议,以帮助规模化猪场早期发现和及时控制PCV3病毒,减轻其对猪群健康和养殖业发展的影响。

猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

2023年成都地区猪圆环病毒3型流行病学调查及遗传进化分析

【目的】调查分析成都地区猪圆环病毒3型(PCV3)的流行与分子遗传进化情况。【方法】试验于2023年1月至2023年12月从成都地区4家无害化处置场采集病死猪组织样品2113份,采用实时荧光定量PCR法检测病料组织PCV3感染情况。设计3对引物对阳性样品的PCV3基因组序列进行PCR扩增并测序。通过在线软件拼接PCV3基因组序列、截取ORF2基因序列并推导其氨基酸序列(Cap),进行相似性比对并构建遗传进化树,分析Cap氨基酸序列突变情况。【结果】组织病料检测结果显示,2113份病死猪组织样品的PCV3阳性率为27.21%(575/2113)。根据PCR扩增测序结果拼接获得了15株PCV3基因组序列。相似性比对分析显示,15株PCV3核苷酸序列相似性为97.2%~100%,ORF2基因核苷酸序列相似性为97.2%~100%,Cap氨基酸序列相似性为96.7%~100%。遗传进化树结果显示,12株PCV3属于PCV3a亚型,3株属于PCV3c亚型。15株Cap氨基酸序列中共13株发生了突变,共存在13个突变位点。【结论】成都地区PCV3主要为PCV3a和PCV3c亚型,基因组相似性高,序列较保守,Cap氨基酸突变位点主要集中在抗原表位。本试验结果提示该地区需制定科学的防控政策,防止病毒蔓延。

猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达与鉴定

[目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白鉴定。[结果]PCV3 Cap蛋白在p ET28a原核表达系统中无表达;Rosetta-p Cold-PCV3-Cap在诱导温度为15℃、IPTG浓度为1.0 mmo L/L、诱导4 h的条件下,能够表达分子量约为25 k Da的Cap蛋白,且为可溶性表达。[结论]试验成功制备了PCV3 Cap蛋白,为制备PCV3疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。

纳米颗粒展示猪圆环病毒3型Cap抗原表位的免疫效果评价

为了验证纳米颗粒展示圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap)串联表位的免疫效果,本试验通过多肽的点杂交和酶联免疫斑点法(ELISPOT)筛选B细胞表位和T细胞表位,通过SpyCatcher/SpyTag(SpyCatcher和SpyTag均为纤维连接蛋白FbaB的结构域,可自发形成异肽键)将表位串联并展示于E2pCD(纳米颗粒展示平台)表面,应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和透射电子显微镜(TEM)分别检测蛋白的表达情况和颗粒组装情况,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术分别检测纳米颗粒展示PCV3 Cap抗原表位免疫后猪血清PCV3抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖水平。结果显示,共筛选出3个B细胞表位[P10:73~87aa(ETAISFEYYKILKMK)、P21:161~175aa(QSLFFFSRPTPWLNT)、P26:201~214aa(YGTKEVWIRYKSVL)]和3个T细胞表位[P20:153~167aa(GTTSAHPGQSLFFFS)、P21:161~175aa(QSLFFFSRPTPWLNT)、P24:185~199aa(LLWSIYVPEKTGMTD)]。SDS-PAGE检测结果显示,SpyCatcher-E2pCD、PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag和SpyCatcher-E2pCD-PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag分子量分别为40、16和55kDa。通过TEM可以检测到SpyCatcher-E2pCD和SpyCatcher-E2pCD-PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag均形成直径约22 nm的纳米颗粒。免疫效果评价结果显示,免疫后21 d时,SpyCatcher-E2pCD-PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag免疫猪产生的特异性抗体水平以及CD4^(+)、CD8^(+)和CD4^(+)CD8^(+)淋巴细胞比例均极显著高于PCV3 Cap(P10-P20~P26)-SpyTag(P<0.001)。结果表明,通过SpyCatcher-E2pCD展示PCV3 Cap串联表位具有较好的免疫效果,可以为PCV3候选疫苗的研制提供借鉴。

猪圆环病毒2型和3型引起母猪繁殖障碍的研究进展

猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员,目前已报道发现4种基因型,猪圆环病毒病对全球养猪业造成重大影响。文章重点对猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)所引起的母猪繁殖障碍进行了综述,旨在进一步提高大家对PCV感染的认识,并为猪场提高生产效益提供参考。

猪圆环病毒3型研究进展

猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的单股环状闭合DNA病毒,是引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原,目前包括4个基因型:PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。其中,PCV3是近年来新发的一种严重危害养猪业的基因型,已经在全球范围呈现广泛流行趋势,引起了国内外学者的广泛关注。本文主要从病原学、流行病学、临床症状、致病机理、免疫反应和诊断方法对PCV3近年来研究情况进行了综述,为PCV3后期的各方面研究提供参考。

猪圆环病毒3型Cap重组鞭毛蛋白融合表达及其免疫原性研究

【目的】利用重组杆状病毒系统表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)Cap重组鞭毛蛋白并研究该蛋白的反应原性和免疫原性,为开发PCV3亚单位疫苗提供数据支持。【方法】通过对Cap基因进行最适密码子优化并与鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因Flagellin进行融合后克隆到pFastBac TMⅠ载体。通过Bac-to-Bac系统,筛选获得重组Cap-Flagellin杆状病毒,利用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blotting鉴定重组杆状病毒,将重组Cap-Flagellin杆状病毒免疫小鼠评价其免疫原性。【结果】重组Cap-Flagellin杆状病毒在Sf9细胞中能有效表达重组蛋白,SDS-PAGE检测可见68 ku的目的条带。IFA结果显示,重组Cap-Flagellin杆状病毒感染后72 h在Sf9细胞膜及胞浆中均出现绿色特异性荧光;Western blotting分析表明,重组蛋白能与PCV3阳性血清发生特异性反应,表明重组Cap-Flagellin蛋白具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,与Cap杆状病毒组相比,重组Cap-Flagellin杆状病毒免疫小鼠2l和28 d后可诱导产生更高水平的Cap特异性抗体(P<0.05;P<0.01),且Cap-Flagellin杆状病毒组小鼠脾细胞白细胞介素-8(IL-8)细胞因子水平显著或极显著高于其他组(P<0.05;P<0.01),表明重组Cap-Flagellin蛋白具有良好的免疫原性。【结论】本研究利用杆状病毒表达系统成功表达了PCV3 Cap重组鞭毛蛋白,并证实其具有良好的生物学活性,为PCV3亚单位疫苗的开发研制奠定了基础。

我国猪圆环病毒3型分子流行病学研究概况

2016年,一种新的圆环病毒在美国被发现,该病毒被命名为猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3),PCV3感染可造成临床猪只呼吸、消化、生殖等多系统炎症。目前,PCV3的致病机制尚不清楚,但人们对PCV3分子流行病学的研究却在不断深入。为了解我国PCV3分子流行病学情况,作者通过对GenBank中我国上传的426条PCV3全基因序列进行整理,借助分子生物学软件对PCV3各基因型统计分析,并统计了我国PCV3分子流行病学相关文献,回顾了我国近年来PCV3流行及其分型研究进展。通过对我国PCV3分子流行病学进行综述,旨在为进一步做好PCV3的防控提供科学依据。

广西猪圆环病毒3型流行病学调查与分析

本研究旨在了解新发猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)在广西猪群的感染情况及流行特点,为有效防控PCV3提供科学依据。试验采用PCR检测方法对2017年9月至2019年3月广西482个规模猪场送检的917份病猪样品进行PCV3检测,并分析PCV3阳性率在广西不同地区、年份、季节和年龄段猪群之间的差异。对145份PCV3阳性病料进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测。结果显示,PCV3除在百色、防城港未检出,在广西其他12个地市均存在不同程度的感染;2017~2019年广西PCV3样品阳性率和PCV3猪场阳性率均呈逐渐上升趋势;夏季PCV3阳性率最低,且明显低于其他3个季节;育肥猪PCV3阳性率最高,为21.70%,其次是流产母猪、保育猪、流产胎儿,阳性率分别为20.00%、19.05%和11.02%,哺乳仔猪PCV3阳性率最低,为8.21%;PCV3单一感染率较高,为30.34%,与其他病原混合感染情况也较为常见,甚至出现四重感染。调查结果表明,PCV3感染在广西普遍存在,且近年来感染呈增加趋势,可能有一定的季节性,对各生长阶段猪群均有一定程度的危害,以育肥猪最为严重,对母猪和保育猪危害也较大;PCV3单一阳性率较高,但仍以混合感染为主,尤其是与PRRSV和PCV2的混合阳性率较高,提示这3种病原在感染致病过程中可能存在协同作用。

PCV2和PCV3双重纳米PCR方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重纳米PCR(nanodPCR)方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano-dPCR的反应条件进行优化;同时考察所建立的nano-dPCR检测方法的特异性和敏感性。结果显示,所建方法的特异性和敏感性良好,对PCV2和PCV3两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6拷贝/μL,其敏感性比普通PCR高100倍。应用该方法对送检的265份临床样本进行检测,结果显示,PCV2和PCV3在猪群中存在普遍感染,PCV3和PCV2的阳性率分别为16.6%和14.7%,混合感染阳性率为6.8%。临床样品的检测结果表明,本试验建立的nano-dPCR方法为PCV2和PCV3早期感染进行快速、敏感鉴别诊断提供了新方法。

重庆市部分地区规模化猪场圆环病毒3型流行情况调查

为了调查重庆地区规模化猪场圆环病毒3型流行情况,研究应用PCR方法,对重庆市部分地区2020年采集的814份全血样品进行检测。结果显示,PCV3的总样品阳性率为3.1%(25/814),其中石柱样品阳性率为16.7%(20/120),南川样品阳性率为1.4%(3/210),彭水样品阳性率为2.2%(2/90);在荣昌、丰都和长寿等地区皆未发现PCV3感染。试验结果为重庆地区的PCV3防控工作提供了科学依据。

猪圆环病毒3型的诊断及防控措施

猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3 PCV3)是一种新型的圆环病毒,可引起猪繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种病症,一般为继发感染和混合感染,给我国的养猪行业带来了较大的经济损失。在疾病诊断方面已有多种方法可以诊断PCV3,但是现在并无治疗PCV3感染的一些药物和能有效预防PCV3发生的疫苗,主要以生物安全预防为主。本文主要对PCV3的临床症状、诊断方法和防控措施进行综述,以期为PCV3的防控以及净化提供参考。

广西首例猪圆环病毒3型的发现及其衣壳蛋白序列分析

【目的】明确猪圆环病毒3型(Porcine circovirustype 3,PCV3)在广西猪群中的致病性及流行病学特点,为有效防控其暴发流行提供参考依据。【方法】采用PCR对广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品进行PCV3检测,并对其唯一结构蛋白质(Cap)的结构进行同源模拟,构建遗传进化树;同时在线(http://www.cbs.dtu.dk/services/)预测Cap蛋白信号肽、糖基化位点和B细胞抗原表位。【结果】在广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品中检测到PCV3。PCR扩增产物经核苷酸序列测定分析后截取Cap基因序列(645 bp),命名为PCV3/CN/Guangxi001/2017。PCV3/CN/Guangxi001/2017与13株国内PCV3毒株和5株美国PCV3毒株的Cap基因序列同源性分别在96.9%~99.4%和98.3%~99.5%,属于3b亚群;而与PCV1毒株和PCV2毒株的核苷酸序列同源性只有43.0%和45.8%,且B细胞抗原表位差异明显,在PCV1特有的B细胞抗原表位(92~103 aa)、PCV2特有的B细胞抗原表位(69~83 aa、117~131 aa和231~233 aa)及PCV1、PCV2共有的B细胞抗原表位(156~162 aa和179~192 aa)均无相似性。【结论】广西猪群中已存在PCV3感染,鉴于PCV2与PCV3间无交叉免疫保护特性,实际生产中应通过加强清洁消毒、灭鼠杀虫、定期监测、自繁自养等生物安全措施防控PCV3暴发流行。

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型(PCV3)重组核衣壳(Cap)蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。

PCV3对仔猪生长相关激素及其功能基因表达的影响

【目的】研究猪圆环病毒3(Porcine circovirus 3,PCV3)对仔猪生长相关激素及其功能基因表达的影响,探索PCV3导致仔猪消瘦的机制。【方法】以8头23日龄的健康断奶仔猪为研究对象,随机均分为PCV3感染组(感染组)、DMEM组,分别从颈部注射3 mL PCV3病毒液(109拷贝/mL)和3 mL DMEM,并于注射前(0 d)及注射后3、7、14、21 d称量仔猪体重,观察其临床表现,采集各组仔猪血清、口腔拭子、鼻腔拭子和肛拭子,采用实时荧光定量PCR检测各样品中PCV3病毒载量;ELISA法测定各组3、7、14、21 d仔猪血清中的三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、甲状腺素4(thyroxine,T4)的浓度;实时荧光定量PCR测定背最长肌、腿肌、脾脏、肝脏组织中生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)等基因mRNA相对表达量。【结果】感染组仔猪终末体重、平均日增重均极显著低于DMEM组(P<0.01),感染组血清、口腔拭子、鼻腔拭子、肛拭子病毒载量均在14 d达到最高;感染组T3表达量在感染的第14和21天均极显著高于DMEM组(P<0.01),T4含量差异不显著(P>0.05)。与DMEM组相比,背最长肌中IGF-1基因的相对表达量极显著降低(P<0.01),腿肌和脾脏中GHR、IGF-1、IGF-1R基因的相对表达量均无显著差异(P>0.05),肝脏中GHR基因的相对表达量极显著增加(P<0.01),IGF-1R基因的相对表达量显著增加(P<0.05)。【结论】仔猪感染PCV3后可导致机体代谢异常,降低IGF-1对背最长肌的促生长、促细胞分裂作用,从而导致仔猪消瘦。

猪圆环病毒3 型感染流行病学研究进展

猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)属于圆环病毒科圆环病毒属,是2016年发现的圆环病毒。本文从PCV3的流行现状、易感动物、传染源及传播途径等方面综述了该病毒感染的流行病学研究进展。国外及国内多个地区的养猪场报道了PCV3感染以及由PCV3引起的疾病,阳性率较高,表明该病毒也是养猪业潜在的重要病原体。PCV3可感染家猪和野猪,且存在多种其他中间宿主;既可通过接触、消化道等进行水平传播,也可从父母代到子代垂直传播。未来应密切监测PCV3与其他猪病原体的合并感染,持续跟踪PCV3优势毒株遗传多样性和分子流行病学的动态变化,开发针对性的PCV3疫苗,加强对PCV3流行的控制,保障养猪业健康发展。

猪圆环病毒3型感染的流行情况与检测方法研究进展

猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)是猪群中流行的一种新型猪圆环病毒。2016—2017年,世界范围陆续报道在猪群中发现PCV3,包括美国、中国、美国、韩国、巴西、波兰和意大利等。PCV3感染多见于具有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍症状的猪群,目前病毒尚未分离成功。本文综述了已报道的PCV3在世界范围内的流行情况,介绍了当前研究的PCV3分子和血清学诊断方法。

猪圆环病毒2型及3型快速二重PCR检测方法的建立及其应用

针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)基因的保守序列设计了2对扩增PCV2和PCV3的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV2和PCV3的二重PCR检测方法。敏感性和特异性结果显示,1.08×10-8μg/μL是对PCV2和PCV3的最低检测限具有较好的灵敏度;而对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、大肠杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带,表明所建立的方法具有较好的特异性。应用该方法检测了2017年9月—2018年8月从广西14个地市猪场采集的533份病猪死猪内脏组织,结果显示:PCV2阳性率为23.8%,PCV3阳性率为14.8%, PCV2和PCV3混合感染率为2.8%。广西14个地市中有12个地市的猪场送检样品检测出PCV2,有10个地市的猪场送检样品检测出PCV3,表明PCV2和PCV3在广西受检猪群中普遍存在,要重视和做好PCV2和PCV3感染的防控工作。

猪圆环病毒3型分子生物学研究进展

猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3, PCV3)是一种新发猪病毒性传染病病原,多见于患有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍症状猪群,目前已于世界范围内普遍流行,引起了各国的格外重视和密切关注,因而成为国内外学者的研究热点。本文对猪圆环病毒3型的病原学特征、基因组结构和特点、编码的主要蛋白及其功能、分子生物学检测技术等国内外最新研究进展进行了综述,以期为后续研究提供参考。