猪圆环病毒病流行现状、新型疫苗与防控措施

1猪圆环病毒病概述。猪圆环病毒病是一种动物病毒。在20世纪90年代,世界范围内人们在病猪及一些无明显临床症状猪体内检测到了一种新型猪小环装样病毒。该病毒与已知的由PK-15细胞培养污染而分离的猪圆环病毒(Porcine circovirus,缩写:PCV)不同。

保育仔猪猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染的诊疗

为查清山西省吕梁市中阳县某猪场从山东购买的保育仔猪大量出现的急性死亡、关节发炎、呼吸困难、高热等症状的病原,无菌采集病猪并带回实验室进行临床剖检,随后采集血液、淋巴结、肺、肾脏和脾脏进行实验室诊断,做出初步判断,制定综合防治策略,病情得到控制。本研究采用灵敏度和准确度较高的实时荧光PCR技术定性检测病料样品中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和副猪嗜血杆菌(HPS)。结果表明:中阳县某猪场保育仔猪为PCV2与HPS混合感染。基于诊断结论对保育猪免疫治疗程序和消毒进行合理调整,综合防治13 d后,猪群无新增发病率和新增死亡率,最大程度地减少了经济损失。本研究为猪场后续的治疗与预防提供了诊断依据。

猪圆环病毒2型和3型检测方法建立及初步应用

为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病毒。本文研究参考GenBank中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别PCV2、PCV3与其他猪病病毒;PCV2最低检测下限为1.00×10^(1)copies/μL,PCV3最低检测下限为1.00×10^(0)copies/μL;重复性高,批内、批间的变异系数分别为0.01%~0.02%和0.02%~0.05%;本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份,PCV2样品符合率为97.47%,PCV3样品符合率为96.85%;测序结果显示,PCV2均为2d亚型,PCV3均为3c亚型。结果表明,建立的双重TaqMan荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确,节约成本,可为PCV2和PCV3的监测与防控提供技术支撑。

昆虫杆状病毒表达的猪圆环病毒2d型Cap蛋白-VLP对仔猪的免疫保护效果

猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组装为VLP的PCV2d-Cap蛋白,然后将9头21日龄健康仔猪随机分为VLP组、攻毒对照组和空白对照组(n=3)。VLP组的每头仔猪经颈部肌肉注射400μg Cap蛋白-佐剂复合物(PCV2d-VLP),攻毒组注射等体积的PBS与佐剂混合物,空白组注射等体积的PBS。共接种2次,每次间隔14 d。于第2次免疫后21 d,VLP组和攻毒对照组的仔猪通过鼻腔感染PCV2 HBDX-2018株(106TCID50/头),评价PCV2d-VLP诱导的免疫效果。结果表明PCV2d-VLP能够诱导仔猪产生高水平的特异性IgG抗体和中和抗体,刺激IFN-γ水平升高,引起外周血淋巴细胞增殖能力增强,降低病毒经鼻腔和直肠的排毒率及病毒血症阳性率,减轻腹股沟淋巴结和脾脏的病理损伤,降低组织中的病毒载量。上述研究表明,应用杆状病毒表达的PCV2d-Cap蛋白能自组装为VLP,并能诱导仔猪产生良好的免疫保护效应,具有进一步开发为PCV2d-VLP疫苗的潜力。

表达PCV2 ORF2的重组T7噬菌体在猪体内的存留分析

为了检测经颈部肌肉注射入猪体的、表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(ORF2)的重组T7噬菌体(T7-ORF2)在体内的存留情况,本试验将PCV2抗原和抗体均为阴性的20日龄仔猪随机分为试验组和对照组,每组5只;试验组猪只以1.5mL/只剂量颈部肌肉注射增殖收获的T7-ORF2,对照组猪只以相同途径注射等体积的洗脱液;于注射前1 d、注射后10 h、1~7 d测量体温,观察猪只的临床症状和死亡情况;分别于注射后1 h、3 h、5 h、10 h、1 d、3 d、5 d和7 d采集猪只的血液和粪便样品,注射后10 h、1 d、3 d、5 d和7 d采集肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结样品;将收集的各样品处理上清与宿主菌(大肠埃希菌BLT5403株)混合培养,通过细菌裂解分析T7-ORF2的感染性;以细菌裂解液提取的基因组DNA为模板进行PCR,检测ORF2基因;通过免疫组织化学检测T7-ORF2在肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结中的分布和存留时间。结果显示,试验组猪只在试验期体温、采食、饮水和精神状态正常,无不良症状和死亡发生;注射后5 d能从血清和粪便中检测到感染性的T7-ORF2;注射后3 d能从肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结中检测到感染性的T7-ORF2;从细菌裂解液中可扩增检测到PCV2 ORF2基因片段;免疫组织化学切片观察结果显示,T7-ORF2在机体中逐渐被清除,在脾脏中存留至少5 d,在肝脏和腹股沟淋巴结中存留至少7 d。结果表明,T7-ORF2可进入猪只的血液循环、肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结中,并随粪便排出体外。本试验为利用T7-ORF2深入开发PCV2新型疫苗提供数据支撑。

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建及拯救病毒的双抗体夹心ELISA鉴定

旨在构建猪圆环病毒2型(PCV2)感染性克隆,并利用双抗体夹心ELISA对拯救病毒进行鉴定。通过PCR从阳性病料中扩增出PCV2两种基因型2b与2d的全基因组DNA,并分别克隆入pMD-19T载体,获得2个重组质粒,命名为p19T-PCV2b与p19T-PCV2d。利用SacⅡ酶切获得l 767 bp的PCV2全基因组,并在体外分别用T4连接酶连接而环化,将环状基因组转染至PK-15细胞,传至P6代,利用间接免疫荧光试验(IFA)对拯救病毒进行鉴定,结果表明PCV2b与PCV2d感染性克隆可拯救出病毒。利用PCV2单克隆抗体(单抗)作为捕获抗体,用辣根过氧化酶(HRP)标记的PCV2多抗作为检测抗体,建立检测PCV2病毒粒子的双抗体夹心ELISA方法,用于PCV2拯救病毒的鉴定。将该检测方法与IFA和半数组织细胞感染量(TCID_(50))结果进行对比分析,结果显示,ELISA检测值与Image-J所计算的IFA荧光强度及TCID_(50)的相关系数分别达到0.7和0.8以上,说明该方法与IFA及TCID_(50)检测结果均具有较强的一致性,可以用于PCV2拯救病毒的快速鉴定。

猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

2023年成都地区猪圆环病毒3型流行病学调查及遗传进化分析

【目的】调查分析成都地区猪圆环病毒3型(PCV3)的流行与分子遗传进化情况。【方法】试验于2023年1月至2023年12月从成都地区4家无害化处置场采集病死猪组织样品2113份,采用实时荧光定量PCR法检测病料组织PCV3感染情况。设计3对引物对阳性样品的PCV3基因组序列进行PCR扩增并测序。通过在线软件拼接PCV3基因组序列、截取ORF2基因序列并推导其氨基酸序列(Cap),进行相似性比对并构建遗传进化树,分析Cap氨基酸序列突变情况。【结果】组织病料检测结果显示,2113份病死猪组织样品的PCV3阳性率为27.21%(575/2113)。根据PCR扩增测序结果拼接获得了15株PCV3基因组序列。相似性比对分析显示,15株PCV3核苷酸序列相似性为97.2%~100%,ORF2基因核苷酸序列相似性为97.2%~100%,Cap氨基酸序列相似性为96.7%~100%。遗传进化树结果显示,12株PCV3属于PCV3a亚型,3株属于PCV3c亚型。15株Cap氨基酸序列中共13株发生了突变,共存在13个突变位点。【结论】成都地区PCV3主要为PCV3a和PCV3c亚型,基因组相似性高,序列较保守,Cap氨基酸突变位点主要集中在抗原表位。本试验结果提示该地区需制定科学的防控政策,防止病毒蔓延。

GNSS天线相位中心模型更新对PPP的影响分析

目前,天线相位中心改正(PCC)模型由igs14.atx更新至igs20.atx,更新后的PCC模型会对精密单点定位的坐标参数估计产生影响。本文对比了更新前后的PCC模型,综合分析了四大全球卫星导航系统(GNSS)的在轨卫星和接收机天线的PCC模型,并选取了31个国际全球卫星导航系统服务组织(IGS)测站的观测数据进行精密单点定位数,通过点位偏差和点位精度来分析模型间差异对测站点位估计的影响。结果表明:在IGS框架和天线产品更新后,全球定位系统(GPS)、格洛纳斯系统和伽利略系统的点位偏差下降0.7、2.4和1 mm,北斗三号全球卫星导航系统(BDS-3)增加了0.3 mm;4个系统的点位精度与更新前相当,变化在1 mm内。多GNSS系统联合处理下定位效果有明显改善,点位偏差平均减少了约1.2 mm,点位精度提高了1.5 mm。除此之外,在IGS20框架下使用igs14.atx中的模型后,4个系统的定位性能受到不同程度的影响。

血凝试验和反向间接血凝试验定量检测PCV2 Cap抗原的研究

为研究能否用血凝和反向间接血凝方法定量检测重组杆状病毒表达的PCV2 Cap抗原,分别使用不同稀释液和不同的动物红细胞测定PCV2Cap抗原的凝集效价,同时使用PCV2Cap单抗致敏绵羊红细胞,检测PCV2Cap抗原、空杆状病毒、CSFV等的反向间接血凝效价(RIHA效价)。结果显示,用猪、鸡、绵羊红细胞在不同稀释液条件下测得的同一批次PCV2Cap抗原凝集效价为3log2~9log2,说明PCV2Cap抗原可凝集猪、鸡、绵羊红细胞,但红细胞不同、稀释液不同,测得的PCV2Cap抗原凝集效价也不同。使用PCV2Cap单抗致敏绵羊红细胞,测得的PCV2Cap抗原RIHA效价为14log2,且纯化后和未纯化的PCV2Cap抗原的RIHA效价均与ELISA定量检测结果有平行关系;空杆状病毒、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TCEV的RIHA效价均小于1log2。说明反向间接血凝方法可定量检测重组杆状病毒表达的PCV2Cap抗原,该方法敏感、特异,适用于疫苗生产中的PCV2Cap抗原的定量检测。

猪圆环病毒2型相关疾病常见问题解析与对策

PCV2是猪圆环病毒相关疾病的首要致病因子,会引起断奶仔猪多系统性衰竭综合征(PMWS)、繁殖障碍(PCV2-RD)以及猪皮炎肾病综合征(PDNS)等疾病,给养猪生产造成巨大的经济损失。该文从PCV2的流行特点、免疫存在问题以及对策等进行分析和讨论,旨在为养猪生产人员提供PCVD的防控思路。PCV2主要存在猪场流行率高、种猪群亚临床感染普遍、保育及育肥前期感染压力大、精液和初乳垂直传播等流行特点。种猪场的亚临床感染会引起仔猪PCV2的早期感染;保育及育肥前期感染压力大的主要原因是仔猪出现早期感染、母源抗体干扰、初乳摄入量不足、免疫抑制等;后备母猪的引种混乱和免疫驯化不到位,会导致后备母猪繁殖障碍及后代的早期感染;公猪精液受到PCV2的污染,会引起母猪的繁殖障碍,同时助推了PCV2在猪群中的流行。因此,对于PCVD的综合防控,需要从后备母猪、基础母猪、仔猪以及公猪出发,制订出适合猪场的免疫程序;配合减少交叉寄养、减低保育舍群体规模和密度、减少使用带毒精液、以及选择合适的消毒剂和消毒程序等管理措施,尽量减低PCV2带来的危害。

猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达与鉴定

[目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白鉴定。[结果]PCV3 Cap蛋白在p ET28a原核表达系统中无表达;Rosetta-p Cold-PCV3-Cap在诱导温度为15℃、IPTG浓度为1.0 mmo L/L、诱导4 h的条件下,能够表达分子量约为25 k Da的Cap蛋白,且为可溶性表达。[结论]试验成功制备了PCV3 Cap蛋白,为制备PCV3疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。

湖南省某育肥猪场4种主要疫病的病原和抗体检测及分析

【目的】对湖南省某育肥猪场新引仔猪进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的血清学和病原学调查,旨在了解猪群中各病毒的抗体水平和病原感染情况,为猪场的疫病防控和净化提供科学依据。【方法】采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对采集的81份血清样本进行抗体检测;并随机抽取30份抗凝全血样本提取核酸后使用商业化qPCR检测试剂盒进行病原检测。【结果】血清学调查结果显示,81份血清样本中CSFV抗体阳性率为13.58%(11/81),PRRSV抗体阳性率为95.06%(77/81),PRV-gE抗体阳性率为0.00%(0/81),PCV2抗体阳性率为93.82%(76/81);病原调查结果显示,CSFV病原阳性率为0.00%(0/30),PRRSV病原阳性率为90.00%(27/30),PRV病原阳性率为0.00%(0/30),PCV2病原阳性率为80.00%(24/30)。批次猪群CSFV抗体水平未达到国家规定标准(> 70.00%),且存在PRRSV和PCV2感染。对该批次猪群紧急补免CSF(猪瘟)活疫苗,接种疫苗2周后再次随机抽取81份血清样本进行抗体检测,CFSV抗体阳性率为27.16%(22/81),仍未达到国家规定标准(> 70.00%)。【结论】该批次猪群中存在PRRSV和PCV2的感染,这可能导致猪只免疫抑制,导致CSF疫苗的免疫失败。结果提示该猪场需做好PRRSV和PCV2的防控与净化,定期监测猪场常见疫病的抗体水平和病原感染情况,优化免疫方案,加强生物安全,保障猪场正常生产活动的开展。

五种常用猪2型圆环病毒疫苗的效果比较与分析

为了比较不同厂家疫苗对圆环病毒2d亚型(PCV2d)的防控效果,试验将相同批次的28 d龄断奶仔猪525头,分成5组,每组105头,分别接种A、B、C、D和E五个厂家的PCV2疫苗。免疫前从每个组中挑选15头断奶仔猪,采血监测PCV2抗体,根据抗体结果再将小猪均衡调配至各疫苗组并标记为后续跟踪监测对象,于60、88、97、107、117、127、137、149、158和181 d龄进行采血监测PCV2感染情况。试验前称取并记录各组猪只的重量,试验期间记录猪只的死淘情况和饲料消耗量,试验后再次称重并计算日增重和料重比。结果显示:感染后各时间点血液PCV2抗原的阳性率整体上,疫苗D组>疫苗A组>疫苗E组>疫苗B组>疫苗C组;死淘率和料重比,疫苗C组<各疫苗组;日增重,疫苗C组>各疫苗组;疫苗C组猪只的血液PCV2抗原阳性率低、病毒血症维持时间短、死淘率低(8.57%)、日增重高(0.738 kg/d)、料重比低(2.644)。说明疫苗C相较其他厂家的疫苗效果更好,更能有效防控PCV2d型毒株的感染。

猪圆环病毒2型和3型引起母猪繁殖障碍的研究进展

猪圆环病毒(PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员,目前已报道发现4种基因型,猪圆环病毒病对全球养猪业造成重大影响。文章重点对猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)所引起的母猪繁殖障碍进行了综述,旨在进一步提高大家对PCV感染的认识,并为猪场提高生产效益提供参考。

规模化猪场猪圆环病毒3型的检疫及防控

猪圆环病毒3型(porcive circovirus type,PCV3)是近年来发现的一种新型病毒,可对猪群造成严重影响。介绍了PCV3病毒及其危害,并阐述了规模化猪场中PCV3病毒检疫方法,包括血清学检测、RT-PCR和测序技术等,提出了有效防控该病毒的建议,以帮助规模化猪场早期发现和及时控制PCV3病毒,减轻其对猪群健康和养殖业发展的影响。

猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗抗原纯化工艺优化和佐剂筛选

为优化重组毕赤酵母表达PCV2 Cap的纯化工艺和筛选佐剂。对破碎压力、循环次数、PEG相对分子质量、PEG终质量分数、pH和NaCl浓度进行筛选,用BCA(bicinchoninic acid)法测定PCV 2Cap质量浓度,并用电镜负染法观察纯化后PCV2 Cap颗粒。分别用国产白油、MONTANIDE^(TM) IMS 2215 VG ST和ISA 206 VG配制PCV 2Cap佐剂疫苗,测定免疫小鼠血清中的抗体水平。结果显示:高压均质仪设定130MPa、破碎循环2次,酵母细胞破碎率达89.74%;PEG纯化PCV2 Cap的优化条件为5%(终质量分数)PEG6000、pH 7.5、0.20 mol/L NaCl,PCV2Cap回收率可达91%,电镜下观察PCV 2 Cap颗粒完整;MONTANIDE^(TM) IMS 2215 VG ST PCV 2 Cap佐剂疫苗接种小鼠后,抗体水平最高,可达1∶5 120。

四川地区一株PCV2的分离鉴定及基因组序列分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)当前流行分离株的基因型和进化特征,本研究对PCV2阳性临床样品进行分离鉴定,并对分离毒株进行全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析,利用MegAlign7.0和DNAstar软件对分离株ORF2基因编码的Cap蛋白进行氨基酸变异分析和抗原指数预测分析。测序结果显示,PCV2分离株(SMU-2022)的全基因组序列长度为1 767 nt。全基因组和Cap蛋白的遗传进化树结果均显示分离株属于PCV2d基因型,与国内外46株参考毒株的相似性在91.8%~99.1%之间,其中与QZ1410毒株的相似性最高,亲缘关系最接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有2个氨基酸特异性突变位点,分别是V30L和T232K。抗原指数分析发现,分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第20-30、40-75、90-100、130-140、195-205、210-220位氨基酸这6个区域。

猪圆环病毒研究进展与防控措施

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)感染引起的一种广泛传播的疾病,给全球畜牧业带来了巨大的损失。临床上,该病主要表现为仔猪多系统衰竭综合征和皮炎肾病综合征两种类型。笔者综述了PCV的生物学特征和流行病学特征,并提出了相应的防控措施,以期为后续研究提供参考。

加热法促进猪圆环病毒2型病毒样颗粒的高效组装

为了提高猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳(Cap)蛋白病毒样颗粒(VLPs)的产量,本试验探索了采用加热法促进杆状病毒-昆虫细胞表达的Cap蛋白体外组装的可行性,通过高效液相尺寸排阻色谱法定量PCV2 Cap VLPs,分析4~56℃加热0~10 h对细胞培养液上清中PCV2 Cap VLPs浓度的影响,并采用透射电子显微镜(TEM)验证;通过监测45℃加热6 h后的细胞培养液上清在4℃放置6个月中PCV2 Cap VLPs的浓度变化,验证PCV2 Cap VLPs的稳定性;通过全能核酸酶消化试验验证宿主核酸对PCV2 Cap VLPs组装的作用;对比加热与未加热工艺的PCV2 Cap VLPs纯化收率,并通过高效液相尺寸排阻色谱偶联多角度激光散射、圆二色光谱、差示扫描量热法和微量热泳动分析2种工艺所得PCV2 Cap VLPs表征的一致性。结果显示,细胞培养液上清中PCV2 Cap VLPs浓度随着温度和时间的延长逐渐升高,其中45℃加热6 h后PCV2 Cap VLPs浓度为未加热的3.77倍,TEM观察进一步验证PCV2 Cap VLPs浓度增加。加热后形成的PCV2 Cap VLPs在4℃储存6个月浓度稳定,未出现解聚现象。全能核酸酶消化试验显示,加热过程中宿主核酸的作用并非关键因素。采用45℃加热6 h后再进行纯化,PCV2 Cap VLPs纯化收率是未加热工艺的2.9倍。经分析,加热与未加热工艺所得PCV2 Cap VLPs具有一致的分子量(2.385×10^(6)和2.361×10^(6) Da)、水力学半径(10.1和10.2 nm)、热转变温度Tm(67.22和66.92℃)、二级结构和特异性抗体亲和力(49.0和76.5 pmol/L),表明两者具有相近结构。本试验为PCV2 Cap VLPs的生产探索了一个提高产量的新方法,为兽用疫苗的研发提供了在抗原性质分析方法上的借鉴。