大肠杆菌poly(A)化mRNA基因片段的RD-PCR克隆

目的研究大肠杆菌(E.coli)中哪些基因mRNA3'端存在poly(A)化。方法利用E.colimRNA中可能存在的poly(A)尾,以oligo(dT)-cellulose进行mRNA的纯化,并以oligo(dT)18为引物逆转录合成cDNA,应用限制性显示-聚合酶链反应(RD-PCR)分离不同组别的基因片段并进行克隆。结果成功克隆100多个基因片段,并对其中30个进行了测序分析。结论细菌mRNA的poly(A)化可能不是偶然和个别的现象。

人PD-L1Ig融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

为获取人PD L1Ig融合蛋白 ,研究其对T细胞的调节效应 ,采用PCR法从pMD18 T/PD L1中扩增出人PD L1基因的胞外段序列 ,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1Fc恒定区基因 ,两者拼接后插入逆转录病毒载体pEGZ Term ,用脂质体法与两个辅助病毒载体共转染 2 93T包装细胞 ,用含病毒颗粒的培养上清反复感染L92 9细胞 ,Zeocin筛选能稳定分泌人PD L1Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆之 ,经无血清培养 ,收集的上清用Dotblot检测、ELISA定量后 ,浓缩并经ProteinG柱纯化 ,再经Westernblot鉴定。以FACS分析纯化蛋白对活化T细胞表达的PD 1结合能力 ,以体外T细胞活化体系观察其对T细胞表型的调节作用。结果表明 ,成功地构建了表达人PD L1Ig蛋白的重组逆转录病毒载体 ;获得的L92 9/PD L1Ig细胞能稳定分泌人PD L1Ig蛋白 ;该蛋白与PD 1受体具有良好的结合能力 ,能抑制T细胞的进一步活化。

猪PD-1及其配体PD-L1和PD-L2 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测方法的建立及应用

本试验旨在研究猪PD-1及其配体在疾病状态下的转录水平,建立检测猪PD-1及其配体的Real-time PCR方法。根据GenBank中猪PD-1、PD-L1和PD-L2基因序列,分别设计3对特异性引物,PCR扩增目的基因片段,回收目的基因片段与pMD18-T连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定正确,作为标准品绘制标准曲线,并进行特异性和重复性检测。结果显示,Real-time PCR的Ct值与模板浓度对数呈良好的线性反比关系,相关系数R2>0.99,熔解曲线出现狭窄单一峰;Real-time PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,呈单一目的条带,无引物二聚体,特异性强;组内和组间重复性检测结果显示,组内和组间的变异系数均小于3%,重复性好;用建立的Real-time PCR方法检测猪自然感染PCV2后PD-1及其配体转录水平,PD-L1和PD-L2转录水平极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05),PD-1转录水平无显著变化(P>0.05)。本试验建立了检测猪PD-1、PDL1和PD-L2mRNA的Real-time PCR方法并进行了初步应用,为猪PD-1、PD-L1和PD-L2基因表达模式研究奠定基础。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患儿G-6-PDmRNA表达的研究

目的检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏症患者及其家系成员的G-6-PDmRNA表达水平,从转录水平探讨其可能的发病机制。方法提取G-6-PD缺乏症患者及其直系家属(患者父亲和/或母亲等)外周血RNA,采用逆转录方法形成cDNA后,运用逆转录实时定量PCR(QuantitativeReal-TimePCR,QRT-PCR)技术,测定G-6-PDmRNA的表达量。使用SPSS10.0统计分析软件将3组进行组间两两比较。结果G-6-PD缺乏症患儿组mRNA表达量为0.57±0.19,父系组为0.74±0.21,母系组为0.67±0.21,患儿组与父系组比较t=-3.18,(P<0.01);与母系组比较t=-2.54,(P<0.05)。结论G-6-PD缺乏症患者的G-6-PD基因发生突变后其G-6-PDmRNA表达量发生了改变,提示该病的发生与在转录水平上发生变化有关,在G-6-PD缺乏症的发病过程中起到一定的作用。

中国水仙八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的克隆及表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是影响类胡萝卜素合成的一个重要限速酶,在植物花色发育过程中起着重要作用。采用RT-PCR技术从中国水仙(Narcissustazetta var.chinensis)幼嫩花蕾中分离到一个新的水仙花色发育相关的PDS基因,命名为NTPDS1(GenBank登记号:EU138883)。该基因长1719bp,具有一个1713bp的完整开放读码框(ORF),编码570个氨基酸。序列分析表明,NTPDS1编码的氨基酸序列与其它植物的PDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,NTPDS1与喇叭水仙亲缘关系最近。利用半定量PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在中国水仙的花、叶片和根中均有表达,但以花器官中表达量最高;在花瓣和副冠中的表达量高于雄蕊和雌蕊。

羊踯躅八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆及表达分析

旨在研究羊踯躅八氢番茄红素脱氢酶基因的功能,为其花瓣着色的分子机理研究提供一定的理论依据。以羊踯躅瓣为材料,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣cDNA中克隆获得到2098 bp的八氢番茄红素脱氢酶基因cDNA序列,命名为RmPDS。序列分析表明,RmPDS基因包含一个长度为1743 bp编码580个氨基酸的开放阅读框。利用NCBI分析该基因的氨基酸序列,Blast序列分析结果显示RmPDS与其他植物PDS蛋白氨基酸的相似性达到87.80%。用MEGA软件构建系统进化树,结果显示羊踯躅PDS与茶树PDS蛋白的亲缘关系最近。荧光定量PCR检测结果表明RmPDS基因在羊踯躅花蕾期和膨大期表达量较低,在初花期表达量最高,盛花期表达量有所降低。RmPDS基因参与羊踯躅花色的形成,研究结果为进一步探究该基因在花色形成中的作用机制奠定基础,同时也为构建杜鹃VIGS体系提供报告基因。

慢性腹透患者透析充分性和营养状况的临床评估

本文对53例慢性腹透（PD）患者通过测定整体尿素清除率（KT／V）、肌酐清除率（Ccr）、蛋白分解代谢率（PCR）、标准蛋白分解代谢率（nPCR）、白蛋白（ALB）、臂肌面积（AMA）来观察腹透的充分性和有关营养状况．结果表明：①KT／V与Ccr有显著相关性（r=067，P＜0．01），其中KT／V＜1．4的16例，Ccr＜50／周14例（占28.3％）；②KT／V、Ccr与PCR、nPCR有显著相关性（r=0．36～0．72，P＜0．01），W、Ts、AMA与PCR有显著相关性（r=0．29～0．27，P＜0．05）；③高龄者、近期透析者ALB偏低．提示KT／V、Ccr是了解透析充分性、调节透析量的有效手段．PCR、nPCR在评估PD患者营养状态中，肥胖及消瘦者可影响nPCR的结果．

PD-L1mRNA与PD-L2mRNA在口腔扁平苔藓中的表达特点及可能作用

目的:研究PD-L1mRNA、PD-L2mRNA在口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)患者外周血与损害组织,以及在不同临床类型与病理分型中的表达特点。方法:采用实时定量PCR方法检测60例OLP患者(斑纹型35例,充血糜烂型25例;不伴异常增生38例,伴轻度异常增生22例)PD-L1mRNA、PD-L2mRNA表达水平,并以10名正常人外周血与黏膜组织作为对照,比较不同临床类型和病理类型OLP患者间PD-L1mRNA、PD-L2mRNA表达水平差异,并分析PD-L1mRNA、PD-L2mRNA在OLP患者外周血与损害组织中表达的相关性。利用SAS6.12软件包中的非配对两样本均数比较的Wilcoxon秩和检验,比较不同组别间的差异。结果:PD-L2mRNA在OLP患者外周血中表达降低,损害组织中表达升高,且在不同临床类型OLP患者之间存在显著差异(P<0.05)。PD-L1mRNA在OLP组与正常对照组之间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PD-L2分子可能在OLP患者全身与损害局部对OLP的发生、发展产生不同的影响。

Real—time RT—PCR检测PD—L1 mRNA在肠癌中的表达

目的探讨肠癌组织中共刺激分子PD—L1mRNA表达水平与肠癌患者临床病理参数的关系。方法Real—timeRT—PCR和检测21例肠癌及其临近正常组织中PD～L1和内参照GAPDH的mRNA表达水平，采用2^-△△Ct法对PD—L1mRNA表达水平进行分析。结果肠癌组织中PD—L1mRNA表达水平显著低于癌旁正常组织（W=127．0，P=0．0281），肠癌组织中PD—L1mRNA表达水平与NM23负相关（P=0．0232）。结论PD—L1参与肠癌的肿瘤免疫应答，检测肠癌组织中B7一H3的mRNA表达水平对评价肠癌患者预后具有参考价值。

CD133、CD68和PD-L1在不同病理级别脑胶质瘤组织中的表达及相关性

目的探讨人脑胶质瘤组织中胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)标志物CD133、肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociated macrophages,TAMs)标志物CD68和负性共刺激分子PD-L1在不同病理级别人脑胶质瘤组织中的表达及其相关性。方法采用免疫荧光双染法检测不同病理级别脑胶质瘤组织中CD68和PD-L1蛋白的共表达情况;采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time fluorescent PCR,q RT-PCR)技术检测30例低级别脑胶质瘤(Ⅰ级和Ⅱ级)组织和30例高级别脑胶质瘤(Ⅲ级和Ⅳ级)组织中CD133、CD68和PD-L1 m RNA的表达,并分析其与临床病理级别之间的相关性。结果脑胶质瘤组织中PD-L1和CD68共表达在肿瘤相关巨噬细胞上,即大部分PD-L1阳性细胞为肿瘤相关巨噬细胞,高级别组CD68和PD-L1蛋白的共表达明显高于低级别组。在脑胶质瘤组织中,CD133、CD68和PD-L1 m RNA的表达水平均与病理分级呈正相关(r=0.647,P<0.001;r=0.499,P<0.001;r=0.445,P=0.001);三者在高级别脑胶质瘤组织中的表达均高于低级别脑胶质瘤组织(P<0.05);脑胶质瘤组织中CD133与CD68 m RNA的表达呈正相关(r=0.525,P<0.001),低级别组和高级别组中两者表达亦呈正相关(r=0.518,P=0.005;r=0.500,P=0.007);脑胶质瘤组织中CD133与PD-L1m RNA表达呈正相关(r=0.431,P<0.001),低级别组和高级别组两者表达亦呈正相关(r=0.398,P=0.036;r=0.417,P=0.027)。结论脑胶质瘤组织中PD-L1主要由肿瘤微环境中的TAMs表达;CD133、CD68和PD-L1表达与脑胶质瘤的恶性程度密切相关。

围绝经期妇女PD-1的表达及意义

目的探讨围绝经期妇女外周血单个核细胞共刺激分子PD-1m RNA和T细胞表面PD-1分子的表达和意义。方法采用Taqman探针实时荧光定量PCR法、流式细胞术检测70例围绝经期、40例绝经后期和30例育龄期组外周血单个核细胞PD-1m RNA的表达。结果 PD-1m RNA的表达在三组间比较差异有统计学意义(P<0.05),与育龄期组相比,围绝经期组及绝经后期组PD-1m RNA表达量均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);T细胞表面PD-1的表达在三组间比较差异有统计学意义(P<0.05),围绝经期及绝经后期组CD4+T细胞和CD8+T细胞的PD-1水平低于育龄期组(P<0.05)。结论共刺激分子PD-1的异常表达可能与围绝经期妇女免疫功能失调有关。

尼古丁对PD大鼠黑质多巴胺能神经元变性的影响

目的探讨尼古丁对帕金森病（PD）大鼠黑质多巴胺能神经元变性的影响及其机制。方法45只大鼠随机分为PBS对照组（CON）、生理盐水＋脂多糖（NS）组、尼古丁＋脂多糖（NIC）组,每组15只。黑质内立体定向注射脂多糖（LPS）或PBS后24h,免疫印迹法检测黑质诱导性一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达变化;黑质注射药物后14d,采用免疫组织化学法观察大鼠黑质酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数量及OX-42阳性细胞形态学变化,RT-PCR及免疫印迹检测黑质TH mRNA及TH蛋白的表达水平。结果与CON组相比,NS组大鼠黑质iNOS表达明显增多,TH阳性神经元、TH mRNA及TH蛋白明显减少,小胶质细胞大多呈胞体大突起短粗的形态;NIC组黑质iNOS表达明显少于NS组,黑质TH阳性神经元、TH mRNA及TH蛋白表达较NS组明显增多,大部分小胶质细胞呈胞体小,突起细长的形态。结论尼古丁可以减轻LPS介导的多巴胺能神经元变性,对多巴胺能神经元有保护作用,其保护机制与抑制小胶质细胞激活、减少iNOS的表达有关。

树鼩PD-1基因的分离、鉴定及表达分析(英文)

PD-1(Programmed cell death 1)是一种抑制性的受体,是免疫球蛋白超家族的成员.大量研究证明PD-1能被诱导而在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞和单核细胞上表达,从而在慢性感染的病因学中起着重要作用.树鼩(Tupaiabelangeri)做为一个理想的模型可被应用于许多人类感染性疾病如乙型病毒性肝炎.为了充分利用树鼩对于感染性疾病的宿主免疫应答模型,我们分离出树鼩PD-1基因.利用迅速扩增cDNA末端PCR(RACE-PCR)技术,从树鼩脾组织中克隆了PD-1基因的全长cDNA序列.序列分析显示树鼩PD-1 cDNA的开放阅读框编码一个由242个氨基酸组成的跨膜蛋白,并且和人类、灵长类和啮齿类中的同源基因有高度相似性.组织分布分析表明在所检测的几种组织中PD-1基因只在脾中表达.此外,淋巴细胞刺激实验显示,利用PMA和ionomycin刺激新鲜分离的树鼩外周血单核细胞(PBMCs)能够诱导PD-1 mRNA水平上的表达.我们的结果为将来进一步探讨树鼩的免疫功能提供了良好的基础.

利用微滴数字PCR进行BRAF V600E突变与PD-L1表达的相关性分析

目的探讨BRAF V600E突变与PD-L1表达的相关性及其表型特征。方法采用免疫组化EnVision两步法对34例朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis,LCH)组织中PD-L1的表达进行检测;qRT-PCR和微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术对BRAF V600E表达水平进行定量并比较两种方法的一致性和灵敏度;分析BRAF V600E携带者的临床病理学特征。结果qRT-PCR法检测LCH患者的BRAF V600E突变率为76.47%(26/34),ddPCR法为82.35%(28/34),两种方法检测的突变率一致性高(Kappa=0.82,P<0.001),且ddPCR灵敏度更高;BRAF V600E高表达者的PD-L1表达水平亦增加(r=0.44,P<0.05);BRAF V600E携带者累及多个重要脏器受损。结论采用qRT-PCR、ddPCR法检测LCH组织中BRAF V600E突变率一致性高,且ddPCR法具有更高的灵敏度;BRAF V600E与PD-L1表达呈正相关。

鸡PD-1及其配体实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为了建立并应用鸡相关免疫抑制性受体及其配体的检测方法，试验根据GenBank中程序性死亡因子-1（PD—1）及其配体PD—Ls（PD—L1、PD—L2）的基因序列分别设计特异性引物，建立这3种基因的SYBRGreenI实时荧光定量RT—PCR检测方法，并对鸡法氏囊病毒（IBDV）感染雏鸡7d的外周血单核细胞（PBMC）中3种基因mRNA表达水平进行检测。结果表明：建立的检测方法在1×10^1～1×10^8copies／μL模板范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0．990，重复性试验的组内及组间变异系数均小于3％；应用所建立的方法对临床样品进行检测，IBDV感染组PBMC中PD-1、PD—L1和PD—L2mRNA表达量与对照组相比均显著升高（P〈0．05）。说明所建立的检测方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。

PD-ECGFmRNA在食管癌中表达的临床意义

目的:探讨血小板衍化内皮细胞生长因子(PD-ECGF)的mRNA表达与食管癌侵袭性的关系.方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定40例食管鳞癌、23例食管腺癌和13例正常食管组织中的PD-ECGF mRNA的水平,分析其与癌细胞类型、分化程度及术后临床病理分期(PTNM)的关系.结果:食管癌组织中PD-ECGF明显较正常食管组织升高(t=3.21,P<0.05),食管腺癌中的PD-ECGFmRNA表达水平是食管鳞癌的2.36倍(t=2.12,P<0.05),所有3级分化癌组织中PD-ECG FmRNA的表达水平是1～2级的2.56倍(t=3.18,P<0.05),而与术后临床病理分期(TNM)无明显相关.结论:PD-ECG FmRNA在食管癌中的表达水平与其细胞类型及分化程度相关,临床治疗应采取相应的方案.

猪PD-1分子及其配体的实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪程序性死亡因子PD-1及其配体PD-L1和PD-L2的基因序列,分别设计了特异性引物和TaqMan探针,以10倍系列稀释的重组质粒pMD-PD-1、pMD-PD-L1和pMD-PD-L2为标准品,对实时荧光定量PCR的条件进行优化,以建立定量检测这3个基因的方法。结果表明,建立的方法在1×10^2-1×10^8copies/μL模板范围内具有良好的线性关系（r^2〉0.99）,扩增效率均高于96%,可检测至少100 copies的阳性标准品。利用该方法对猪外周血单核细胞中这3个基因的表达情况进行了检测,结果也表明该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可应用于临床样品的检测。

巢式PCR克隆猪T细胞表面抑制性受体PD-1全长基因

为了获得猪T细胞表面抑制性受体PD-1的全长基因,本研究根据猪T细胞表面抑制性受体PD-1的c DNA序列,设计合成2对引物P1/P2、P3/P4,并在P1和P2的5'端分别引入Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点。应用巢式PCR技术从感染猪瘟病毒(CSFV)石门株的猪外周血单个核细胞中,扩增获得了大小为866 bp的基因片段。将扩增的目的基因回收、纯化,克隆至p MD-18 T克隆载体,转化宿主菌DH5α。菌液PCR和质粒PCR选择可疑阳性重克隆质粒,抽提质粒,然后用Eco RⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,最后进行基因序列测定。结果表明,成功构建猪PD-1全长基因的重组质粒(p MD-PD1)。