原发性胆汁性肝硬化HLA-A* 0201限制性PDC-E2特异性CTL功能分析

目的:探讨原发性胆汁性肝硬化(PBC)中HLA-A* 0201限制的PDC-E2159-167特异性CTL与PDC-E2165-174特异性CTL功能。方法:分析15例HLA-A*0201阳性(A2+)PBC患者抗原肽PDC-E2159-167、PDC-E2165-174诱导的CTL对以表达HLA-A* 0201分子的T2细胞作为靶细胞的细胞毒性作用,并利用四聚体技术结合细胞内因子染色研究PDC-E2159-167特异性CTL与PDC-E2165-174特异性CTL分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4和TNF-α)情况。结果:15例A2+PBC患者中,12例PDC-E2159-167诱导的CTL和10例PDC-E2165-174诱导的CTL对负载相应抗原肽的靶细胞特异杀伤活性大于10%(E∶T=40∶1),而对照组则均小于10%;15例A2+PBC患者从PBMC诱导的PDC-E2159-167特异性CTL和PDC-E2165-174特异性CTL中分泌IFN-γ细胞比值分别为0.33%±0.24%(0%～0.86%)、0.27%±0.24%(0%～0.75%),未检测到分泌TNF-α或IL-4的PDC-E2159-167或PDC-E2165-174特异性CTL。结论:结果表明,大部分PBC患者中HLA-A* 0201限制性PDC-E2159-167特异性CTL和PDC-E2165-174特异性CTL具有特异杀伤活性,HLA-A* 0201限制性PDC-E2特异性CTL主要分泌IFN-γ并非IL-4、TNF-α。

EBV-LMP2多肽激活的特异性CTL抑制同HLA-I亚型的鼻咽癌移植瘤形成

目的:研究异体的EBV-LMP2表位多肽所激活的特异性CTL对具有相同HLA-Ⅰ类分子亚型鼻咽癌细胞(CNE2) 移植瘤的抑制作用,探讨异体间的免疫治疗。方法:先将CNE2细胞接种于Scid鼠背部皮下建立移植瘤模型;然后通过SSP- PCR确定CNE2的HLA-Ⅰ类分子亚型,并选取与CNE2有相同HLA-Ⅰ类分子亚型的外周血淋巴细胞;实验再将3组不同细 胞分别接种于Scid鼠北部皮下,(1)对照组:仅接种CNE2细胞;(2)T细胞组:接种未激活的淋巴细胞与CNE2混合细胞。 (3)CTL组接种经EBV-LNP2多肽激活的特异性CTL与CNE2混合细胞。观察EBV-LMP2多肽激活的CTL对CNE2移植瘤生 长的影响。结果:CNE2于一周左右在Scid鼠背部形成肿块,病理学鉴定为低分化上皮癌;SSP-PCR显示CNE2含有HLA-A11 基因位点;含有相同基因位点的DC负载LMP2-A11多肽所激活的CTL,明显抑制CNE2移植瘤生长。结论:EBV-LMP2多肽 所激活的特异性CTL抑制HLA亚型相同的CNE2移植瘤的形成。

EBV-LMP2多肽所激活的特异性CTL对鼻咽癌细胞杀伤活性的研究

[目的]研究EB病毒编码的LMP2多肽片段所激活的肿瘤特异性CTL对鼻咽癌细胞的杀伤作用,探讨利用LMP2多肽对鼻咽癌进行免疫治疗。[方法]通过细胞免疫方法鉴定鼻咽癌细胞(CNE2)中的LMP2蛋白是否表达;外周血分离树突状细胞(DC)体外培养,以LMP2多肽片段负载DC激活产生特异性CTL;通过流式细胞仪、MTT法检测特异性CTL对CNE2细胞杀伤活性。[结果]在CNE2中表达LMP2蛋白,LMP2多肽所激活的肿瘤特异性CTL对鼻咽癌细胞具有杀伤活性。[结论]LMP2多肽片段所激活的肿瘤特异性CTL在体外对鼻咽癌细胞具有杀伤作用。

H-2K^d四聚体的制备及其在检测特异性同种CTLs中的应用

目的制备H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽/H-2Kd四聚体并用于检测相应的特异性同种CTL。方法以原核表达的sH-2Kd-BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的GAD抗原肽在体外利用稀释法进行共折叠复性得到单体。然后在BirA酶作用下对其进行生物素化,通过凝胶过滤层析法纯化生物素化的复合物单体,再与Strep-tavidin-FITC按4∶1比例混合形成四聚体;取Balb/c小鼠(H-2Kd)巨噬细胞加载胰岛GAD抗原肽,作为刺激细胞,取C3H小鼠脾细胞(H-2KK)作为效应细胞,在体外进行混合淋巴细胞培养,以获得针对H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽的特异性同种CTL。结果该四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的同种特异性T细胞结合。结论成功构建胰岛GAD抗原肽/H-2Kd四聚体,并可用于针对H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽特异性同种CTL的检测。

IL-2基因转导自身肿瘤特异性细胞毒T细胞对小鼠实体瘤作用的实验研究

许多研究发现自身肿瘤特异性细胞毒T细胞(CTL)能定位于体内肿瘤所在部位．其杀瘤细胞活性及特异性远在LAK细胞之上，来源和增殖性方面较TIL为优，因此可作为较为理想的载体细胞导入各种治疗基因。将IL-2基因导入CTL中表达并回输．通过其聚集在肿瘤发生局部持续分泌一定量的IL-2，激活机体肿瘤免疫反应或直接杀伤肿瘤细胞，

原发性胆汁性肝硬化PDC-E2特异性T细胞拮抗性模拟肽的筛选

目的筛选可拮抗原发性胆汁性肝硬化(PBC)中PDC-E2_(165-174)特异性CTL功能的模拟肽。方法以自身抗原表位PDC-E2_(165-174)(LLAEIETDKA)为原型肽,采用丙氨酸突变扫描法,通过亲和力分析及其对PDC-E2_(165-174)特异性CTL细胞毒性和分泌细胞因子等功能的抑制效应,从中筛选拮抗性模拟肽。结果8条模拟肽中,5号位突变的模拟肽(I5A)显示与HLA-A*0201分子高亲和力,5名PBC患者PDc-E2 特异性CTL对其负载的T2细胞的杀伤率均小于10％,并且I5A也未能诱导PBC患者PDC-E2特异性CTL 产生IFN-γ。在原型肽的存在下,I5A可抑制PDC-E2_(165-174)CTL细胞毒性和分泌IFN-γ,随着模拟肽浓度增加,抑制效应越强,在10 μmol／L浓度时可以明显抑制PDC-E2_(165-174)CTL的细胞毒活性和分泌IFN-γ的能力。结论模拟肽I5A(LLAEAETDKA)可能是PDC-E2_(165-174)特异性CTL的一个拮抗性多肽,其抑制效应并不是其能竞争结合靶细胞上的HLA-A*0201分子,而是对TCR的一种拮抗作用,为将来设计以TCR为基础的特异性免疫治疗提供实验依据。

抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅴ CD3AK介导的MHC非限制性溶瘤作用的机制分析

MHC(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类抗原缺失是一些肿瘤细胞逃逸抗原特异性CTL攻击的重要机制。CTL能否通过MHC非限制性，MHC Ⅰ类非依赖性机制杀伤肿瘤细胞是值得深入探讨的。我们用抗CD3单抗和rIL-2共刺激法诱导的CD3AK作为效应细胞，研究了CD3AK对两株MHC Ⅰ类阴性肿瘤细胞株K562和Daudi杀伤作用，

前S2抗原基因对乙型肝炎DNA疫苗免疫应答的影响

目的:探讨前S2抗原基因对乙型肝炎DNA疫苗免疫应答的影响. 方法:采用常规PCR法从adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBV S和前S2+S基因片段,重组到VR1012载体中, 转染COS-7细胞并免疫BALB/C小鼠.采用蛋白印迹、ELISA,ELISPOT等方法检测其在COS-7细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫. 结果:转染的COS-7细胞表达相应的目的蛋白,且前S2+ s转染的细胞表达明显高于S转染的细胞的表达;免疫接种小鼠后2wk产生HBsAb及HBsAg特异性CTL,前S2+ S抗原免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL均强于S 抗原免疫. 结论:前S2抗原基因可增强乙型肝炎DNA疫苗刺激的免疫应答.

sH-2K^d-HBc四聚体的构建及其初步的检测应用

目的:sH-2Kd-HBc复合物四聚体的构建与检测,为进一步检测抗原特异性T细胞,探讨免疫发病机制奠定基础。方法:将四个生物素化的可溶性复合物单体与荧光标记的亲和素结合形成四聚体。采用HBcAg真核表达质粒(pcDNA3-C)通过不同的途径免疫小鼠,获得针对核心抗原的特异性CTL,与制备的四聚体共孵育,结合流式细胞仪术进行检测。结果:三种免疫方法所得到的细胞中,抗原特异性CTL频数较对照组都有明显提高(0.24%,0.26%,0.36%vs 0.07%,P≤0.05)。显示制备的四聚体能与抗原特异性T细胞结合,具有检测功能。三种不同的免疫途径所引起的抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答强度各有不同。与传统的肌肉注射组相比,基因枪免疫组的体液免疫应答水平较弱而细胞免疫应答水平较强。高压水注射(HDI)组的体液免疫应答和细胞免疫应答水平都要明显高于肌肉注射组结论:获得了功能性的sH-2Kd-HBc复合物四聚体,为进一步检测抗原特异性T细胞奠定基础。

H-2K^b-OVA复合物的构建及体内特异性CTL的诱导

在扩增了H 2Kb 基因后 ,将可生物素化的序列连接到其胞外区末端 ,构建成可溶性重组分子 ,进行原核表达。通过定点突变获得了高表达的融合蛋白 ,再利用 6×Histidinetag进行蛋白纯化 ,在对H 2Kb分子高亲和力的OVA2 57 2 64肽及 β2 m蛋白存在下 ,三者体外折叠成具有完整构象的H 2Kb OVA类分子复合物。用其作为免疫原诱导特异性CTL ,并构建H 2Kb OVA四聚体检测特异性CTL。应用H 2Kb OVA四聚体对特异性CTL检测结果与经典的细胞毒试验一致 ,同时对胞外IFN γ进行了检测。说明H 2Kb OVA复合物可有效诱导体内特异性CTL反应 ,在体外构建MHC I类分子四聚体 。

最新信息四则：一、丙型肝炎发病机制与Th1／Th2平衡（医学のめぬみ214：270-272，2005．广石和正）

近年研究提示，CTL应在HCV感染中可能有抑制病毒生长作用，病毒特异性CTL在初感染时的病毒消除上发挥有重要功能。于HCV已告清除的病例，在其后35年的漫长期间里均可验证有对HCV之CD4＋与CD8＋T细胞之应答。遗憾的是HCV感染的机体免疫应答不够强，病毒惹发的急性肝炎肝损害不重。故而容易造成转为持续感染。如果诱发Th1免疫应答则可酿成急性或亚急性重型肝炎而导致重度肝损害。

广西地区三类人群EB病毒潜伏膜蛋白2特异性细胞免疫状态的研究

目的 初步探讨广西地区鼻咽癌患者、血清VCA/IgA阳性高危人群及血清VCA/IgA阴性健康人群EB病毒LMP2特异性细胞免疫状态的差异.方法 选择广西苍梧地区经血清学筛查VCA/IgA阳性高危人群志愿者60例,对照为血清VCA/IgA筛查阴性的健康志愿者20例,同时选取广西壮族自治区人民医院经病理确诊鼻咽癌患者134例,分离外周血单个核细胞（PBMC）,采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测外周血中LMP2特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫水平.比较鼻咽癌患者与健康志愿者、高危人群外周血LMP2特异性CTL免疫状态的差异.结果 鼻咽癌患者LMP2特异性CTL免疫水平明显低于健康志愿者及血清EB病毒抗体阳性人群,差异有统计学意义（P＜0.01）;血清EB病毒抗体阳性三种不同滴度人群间LMP2特异性T细胞免疫反应差异有统计学意义（P=0.002）;鼻咽癌Ⅰ、Ⅱ期患者同Ⅲ期及Ⅳ期患者的LMP2特异性T细胞免疫反应存在差异（P＜0.01）.结论 三类人群间LMP2特异性CTL水平的差异可能是导致EB病毒长期潜伏感染并导致鼻咽癌发生的重要原因,针对LMP2的特异性免疫治疗有望降低鼻咽癌的发生率.

HLA-A2肽四聚体的构建及其在乙、丙型肝炎中的初步应用

目的 分别构建乙型肝炎病毒 (HBV)和丙型肝炎病毒 (HCV)特异的HLA A2肽四聚体 ,为检测乙、丙型肝炎患者体内特异性的细胞毒T细胞 (CTL)提供直接、有效的方法 ,指导临床用药。方法 分别构建含有HLA A2 BSP(含有 15个可供识别生物素化的氨基酸位点 )和 β2微球蛋白(β 2m)基因的原核表达载体 ,并进行表达、复性、鉴定及纯化。再分别将HBV和HCV特异性短肽与HLA A2 BSP和 β 2m蛋白在体外进行耦合 ,该复合物经纯化浓缩后进行生物素化。生物素化的产物经纯化浓缩后形成单体 ,此单体再与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成四聚体 ,最后进行流式细胞仪检测。结果 获得了高效、稳定的pBV2 2 0 HLA A2 BSP和 pBV2 2 0 β 2m原核表达载体 ,表达量分别占菌体的 4 6 %和 2 6 %左右 ;纯度达 90 %以上。构建的四聚体可成功的检测急、慢性乙型和丙型肝炎患者中特异性的CTL ,急性HBV感染时CTL占 1 84 % ,慢性HBV感染时CTL占0 0 2 %～ 0 6 8% ,慢性HCV感染的CTL占 0 0 2～ 0 72 %。结论 高效、稳定的pBV2 2 0 HLA A2 BSP和 pBV2 2 0 β 2m原核表达载体大量的表达可用于构建各种肽特异性的四聚体复合物 ;在体外构建的MHC Ⅰ类分子四聚体 ,为特异性细胞毒T细胞的检测提供有效的工具。

转染肿瘤mRNA的树突状细胞疫苗诱导抗肝癌免疫研究

目的 探讨转染原发性肝癌(HCC)mRNA的树突状细胞(DC)能否诱导抗肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法 采用HCC患者外周血单核细胞(PBMC)体外刺激分化为DC细胞;从人肝癌HepG 2细胞和3例HCC患者的肝癌组织中体外扩增mRNA。以mRNA转染DC细胞,并与PBMC混合培养诱导扩增CTL。流式细胞计数仪检测培养细胞中CD3 +、CD4+、CD8+细胞的比例。51Cr释放法测定CTL的杀瘤活性。结果 经扩增人肝癌HepG 2mRNA和2例AFP(+ )患者的AFP(+ )HCCmRNA诱导3周后,CD3 +、CD8+细胞占淋巴细胞总数由诱导前的2 7.8%、2 6.5 %、2 9.6%升高至89.3 %、73 .6%、86.8% ;而经扩增AFP(-)HCCmRNA诱导3周后,CD3 +、CD8+细胞占淋巴细胞总数由诱导前的2 5 .4%升高至5 3 .6%。转染HepG 2细胞和AFP(+ )的患者HCCmRNA的DC诱导的CTL对HepG 2细胞杀瘤活性明显高于AFP(-)的患者,其杀瘤特性由MHC I限制的CD8+T细胞所介导。结论 HCCmRNA体外转染DC能诱导肿瘤特异性CTL 。

慢性HBV感染者调节性T细胞、黏附细胞对细胞毒T淋巴细胞体外增殖的影响

乙型肝炎患者体内细胞毒T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocytes，CTL）的功能和数量直接影响着病毒的清除和肝细胞的损伤。本实验主要探讨慢性HBV感染者调节性T细胞（Tr）、黏附细胞（AC）对HLA-A2限制的HBV特异性CTL体外增殖的影响。