人PDGF-A基因的克隆、表达及表达产物的纯化

目的 克隆血小板衍生的生长因子A链 (PDGF A)的基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 利用RT PCR法 ,从人肝癌细胞系 (HHCC)的总RNA中 ,扩增PDGF A的全长cD NA ,再用PCR法扩增PDGF A成熟蛋白的全长编码序列。编码序列经测序验证后 ,克隆入表达载体pGEX 4T 1中 ,构建PDGF A的原核表达载体 ,在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白 ,并进行谷胱甘肽 (GST)亲和层析纯化。结果 以RT PCR扩增的PDGF A基因的全长为 12 5 5bp ,以PCR扩增得到其成熟蛋白的编码序列为 5 31bp。构建了PDGF A基因的原核高效表达载体pGEX PDGF A ,表达产物主要位于包涵体内。对包涵体蛋白进行变性和复性处理后 ,利用亲和层析法获得纯化的目的蛋白。结论 成功地扩增到PDGF A成熟蛋白的编码序列 ,并在大肠杆菌高效表达 ,为进一步对PDGF

PDGF-AmRNA与PDGF-A蛋白在宫颈鳞癌的表达及其临床意义

目的研究PDGF-A基因与宫颈鳞癌发生与发展的关系。方法采用原位杂交和免疫组化法,对87份宫颈鳞癌和23份正常及慢性宫颈炎组织PDGF-AmRNA、PDGF-AA蛋白进行检测。结果①PDGF-AmRNA在宫颈鳞癌中表达率为71%,与宫颈鳞癌组织分化程度、淋巴结转移明显相关(P<005)。②宫颈鳞癌组织中PDGF-AA蛋白阳性率为78%较正常宫颈、慢性宫颈炎组织表达17%显著增加(P<001)。PDGF-AA表达与宫颈鳞癌组织分化程度、宫颈鳞癌临床分期、淋巴结转移均明显相关(P<005)。③一致性检测发现宫颈鳞癌组织中PDGF-A基因的免疫组化与原位杂交检测结果关系密切(P<001)。结论PDGF-AA、PDGF-AmRNA与宫颈鳞癌的生长、浸润、转移有密切关系,可作为判断宫颈鳞癌生物学行为和预后的重要指标。

血小板源性生长因子受体-α及其配体PDGF-A在人乳腺癌中表达的意义

目的:探讨乳腺癌组织中血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)与血小板源性生长因子-A(PDGF-A)表达,两者的表达相关性,及其在淋巴结转移中的作用。方法:以免疫组织化学方法检测PDGFR-α和PDGF-A的蛋白表达,分析PDGFR-α与淋巴结转移等临床病理参数间关系。结果:在所检测的样本中PDGFR-α和PDGF-A在乳腺癌组织中的阳性表达率分别为51.7%和61.7%,其表达与淋巴结转移具有一定的相关性(P<0.01)。同时PDGFR-α的表达与PDGF-A也具有一定的相关性。结论:PDGFR-α与PDGF-A能够在乳腺癌中高表达,可能有助于肿瘤细胞发生淋巴结转移。

PDGF-A和MVD在大肠癌中的表达及预后意义

目的:探讨血小板衍生生长因子A(Platelet-Derived Growth Factor-A,PDGF-A)和微血管密度(Microvessel Density,MVD)在大肠癌组织中表达与患者生存预后关系。方法:收集10年间收治生存期≥5年及≤3年大肠癌患者标本各30例,应用免疫组织化学测定这60例大肠癌组织中PDGF-A和MVD表达,分析检测结果与临床病理特点及患者预后关系。结果:≥5年30例大肠癌患者其PDGF-A,MVD表达强度与≤3年30例大肠癌患者在病理学分级,淋巴结转移间比较,均有显著性差异(P<0.05),而性别,年龄,TNM分期及浸润深度差异性不显著(P>0.050),且PDGF-A与MVD表达两者呈正相关(r=0.965,P<0.05)。结论:PDGF-A对大肠癌生长和转移可能有促进作用,PDGF-A和MVD可以作为判断大肠癌患者预后重要参考指标。

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒，为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中，将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中，经Ｇ４１８筛选并扩增，以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，测病毒滴度，选择出抗性克隆，进行免疫组织化学检测，表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ；免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达；抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备，该基因获得有效表达，表达产物具有明显的致丝裂活性。

自体血管移植后内膜增生与PDGF-A表达的变化及意义

目的 观察血小板源性生长因子A链 (PDGF A)在自体动静脉移植后不同时期的表达情况 ,探讨其与移植后血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖的关系和在内膜增生 (IH)中的作用。方法 建立大鼠自体动静脉移植模型 ,应用组织形态学方法观察移植血管内膜增生的动态变化特点和采用免疫组织化学方法观察PDGF A在移植后不同时期的表达情况。结果 游离动脉和静脉移植后发生内膜增生 ,静脉较游离动脉内膜增厚明显 ;PDGF A在移植后持续表达至 1 0周 ,高峰在 4～ 6周 ,静脉较游离动脉表达更显著。非游离动脉无明显变化。结论 移植血管中 ,静脉内膜增生最明显 ,而非游离动脉无明显内膜增生 ;PDGF A与VSMCs的增殖关系密切 ;另外可能有促进移植后晚期细胞外基质 (ECM)

PDGF-A基因修饰皮片对眼睑皮肤创伤修复的研究

目的利用PDGF-A基因修饰的全层皮肤皮片，利用HE染色、PCR、蛋白定量分析几个层面，探讨其对眼睑皮肤损伤修复的情况及部分机理。方法贵州小香猪6只，背部脊柱两侧造成全层皮肤缺损圆形创面（Ф3．67cm）各3个，共36个创面。A组（基因修饰皮片组）“PDGF-A基因修饰皮片”，移植到其右侧的18个创面作为实验组；B组（细胞皮片植入组）以HAM负载未经基因修饰的自体bMSCs与角朊细胞，构建成“细胞皮片”植入其左侧前6个创面；C组（单纯HAM敷盖组）单纯HAM敷盖其左侧后12个创面，作对照组。观察移植后1～4周内，各组创面愈合、肉芽组织生长、上皮化等情况。并进行创面组织HE、Laminin免疫组化及胶原含餐等检测。结果（1）A组于伤后15～17d愈合，B组于伤后21～23d愈合，C组于伤后24～26d愈合，A组较其它两组分别提前5～6d与8～9d愈合，且愈合质量好。（2）A组创面于移植15～17d，其肉芽组织生长旺盛，肉芽组织中Laminin、成纤维细胞和毛细血管含量丰富，可见胶原沉积。两对照组创面组织仍见许多炎细胞浸润，肉芽组织中Laminin、成纤维细胞和毛细血管含量少，胶原沉积不明显。结论PDGF-A基因修饰皮片移植对眼睑皮肤的创伤有较好的促愈作用，愈合质量较高。

IFN-γ抑制血管成形术后兔血管平滑肌细胞增殖和PDGF-A的表达

目的和方法：采用体外细胞培养，进行氚标胸腺嘧啶核苷（３Ｈ－ＴｄＲ）掺入和原位杂交。结果：发现γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）能抑制体外培养新西兰兔血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）的ＤＮＡ合成和血小板衍化生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）的基因表达；整体实验中，用４ＦＦｏｇａｒｔｙ导管气囊拉伤新西兰兔的腹主动脉内皮后，随即连续肌注ＩＦＮ－γ（１６５万Ｕ·ｋｇ１·ｄ１）３天，结果发现肌注ＩＦＮ－γ能明显抑制受损部位ＶＳＭＣ的３Ｈ－ＴｄＲ的标记率及ＰＤＧＦ－Ａ的表达。结论：ＩＦＮ－γ对血管成形术引起的血管挛缩有一定的舒张作用。

COPD气道黏液高分泌模型大鼠IL-13、ICAM-1、PDGF-A的表达

目的探讨COPD气道黏液高分泌模型大鼠IL-13、ICAM-1、PDGF-A的表达。方法通过复制COPD气道黏液高分泌大鼠模型,予氨溴索、泼尼松干预,检测支气管肺泡灌洗液BALF及血清中IL-13、ICAM-1、PDGF-A的表达水平。结果模型组支气管肺泡灌洗液BALF及血清中IL-13、ICAM-1、PDGF-A较正常组明显升高(p <0. 01),泼尼松组和氨溴索组较模型组明显降低(p <0. 01)。结论 COPD气道黏液高分泌模型大鼠IL-13、ICAM-1、PDGF-A呈现高表达,泼尼松、氨溴索具有一定的保护作用。

p33^(ING1)、PDGF-A及bFGF在ARC患者晶状体上皮细胞中的表达及临床意义

目的分析p33^(ING1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及血小板源性生长因子A(PDGF-A在年龄相关性白内障(ARC)患者晶状体上皮细胞中的表达及临床意义。方法选取2018年4月至2019年4月本院收治的67例ARC患者作为ARC组,选取同期来院就诊的70例近视矫正手术者作为对照组。采用连续环形撕囊法取下ARC组和对照组人晶状体中央直径5 mm范围内的前囊膜,比较两组p33^(ING1)、bFGF、PDGF-A mRNA表达水平,测定各组氧化应激因子[丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)],Pearson分析p33^(ING1)、b FGF、PDGF-A mRNA表达水平与氧化应激因子的相关性。结果ARC组p33^(ING1)表达水平低于对照组,PDGF-A及bFGF mRNA表达水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ARC组GSH-Px水平低于对照组,MDA水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson分析结果显示:ARC患者p33^(ING1)mRNA表达与GSH-Px水平呈正相关关系(P<0.05),与MDA水平呈负相关关系(P<0.05);PDGF-A及bFGF mRNA表达水平与GSH-Px水平呈负相关关系(P<0.05),与MDA水平呈正相关关系(P<0.05)。结论p33^(ING1)、PDGF-A及bFGF mRNA水平在ARC患者晶状体上皮细胞中呈异常表达,三者水平与ARC患者氧化应激呈明显相关性,检测其水平有利于临床病情评估。

肝细胞肝癌(HCC)中PDGF-A的表达及其临床意义

目的阐明血小板源性生长因子A(platelet-derived growth factor A,PDGF-A)在人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达情况及临床意义。方法在手术切除的50例HCC组织中,应用定量RT-PCR的方法检测PDGF-A mRNA水平,并分析其与临床病理分期之间的关系。采用Western blot检测正常肝细胞株L02和7株肝癌细胞株中PDGF-A蛋白质水平。运用免疫组化方法在43例HCC石蜡组织中检测PDGF-A蛋白质水平。再利用免疫荧光双染色方法检测HCC组织中间质区域炎症细胞中PDGF-A与炎症细胞标志物(CD4、CD8、CD19和CD68)共表达情况。结果与相应癌旁肝组织相比,HCC癌组织PDGF-A mRNA水平升高,约50%(24/50例)癌组织PDGF-A mRNA水平是癌旁肝组织的2倍及以上,这种差异在BCLC 0期和C期的HCC病例中更为显著。PDGF-A蛋白质见于L02、SMMC-7721、HCCLM3和MHCC97-H细胞株,而HepG2、Hep3B、Huh7和BEL-7402细胞株未检测到该蛋白质。近60%的HCC病例中,肝癌细胞表达PDGF-A,阳性染色有两种分布方式:弥漫于胞质内及在细胞质/细胞膜局部聚集。PDGF-A也大量分布于肿瘤间质区域和紧邻癌组织间质区域的炎症细胞(CD4^+、CD8^+、CD19^+和CD68^+)中。结论HCC癌组织PDGF-A基因表达高于癌旁肝组织,在早期和进展期(BCLC 0和C期)病例更为明显;PDGF-A蛋白表达于HCC癌细胞和间质炎症细胞。

异源PDGF-A链表达对CHO细胞生长和转化的作用

用DNA磷酸钙盐沉淀方法把含人PDGF(血小板衍生生长因子)A链cDNA的表达质粒pSV_2neo-A转染CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞),然后经G 418(400-800 μg/ml)筛选分离20个转染细胞株。选出其中At_1和Aot7细胞株所进行的实验结果表明,这些细胞的形态和生长行为均发生明显的变化,PDGF-A链mRNA的表达水平比CHO细胞明显增高,胞质有强阳性的PDGF荧光反应,显示有PDGF样蛋白的合成。这些细胞不但生长速率加快,有高密度持续生长的特性,而且能在软琼脂培基上形成大集落和在裸鼠体内接种形成纤维肉瘤,提示外源PDGF-A链基因的表达有使CHO细胞生长失控和发生细胞恶性转化的作用。

人血小板衍生生长因子A链(PDGF-A)反义RNA表达克隆的构建

利用DNA重组技术,我们将PDGF-A第一个外显子DNA片段和PDGF-A cDNA反向克隆到pSV_2 neo中,构建成两种PDGF-A反义RNA表达克隆。该两种PDGP-A反义RNA表达克隆可用于PDGF-A功能的研究以及肿瘤细胞生长阻断的探索。

PDGF-A及bFGF表达与移植血管平滑肌细胞增殖的关系

目的探讨血小板源性生长因子Ａ（ＰＤＧＦＡ）和碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）与移植血管平滑肌细胞增殖的关系。方法建立３２只大鼠自体静脉移植模型，分别于术后６小时、４８小时、１周、２周、４周切取移植静脉，应用免疫组织化学动态观察不同时期移植血管ＰＤＧＦＡ及ｂＦＧＦ表达情况。结果ＰＤＧＦＡ的变化在时间上与血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）增殖活性的变化是相对平行的：均于术后逐渐增加，于１周达高峰，与术后６小时相比差异有极显著意义（Ｐ＜００１）。ｂＦＧＦ分别于术后２天及２周出现两个高峰，与其他时间组相比差异均有显著性意义（Ｐ＜００５）。结论ＰＤＧＦＡ对移植静脉ＳＭＣ迁移和增殖起重要作用，ｂＦＧＦ除对ＳＭＣ增殖起促进作用外，而且可能参与内皮化过程。

PDGF-A、PDGFR-α在单纯创伤和照射复合创伤愈合过程中伤口成纤维细胞内的表达与意义

目的 探讨局部照射对创伤愈合过程中伤口成纤维细胞PDGF A及PDGFR α表达的影响及意义。方法 将 132只Wistar大鼠分为单纯创伤组 (对照组 )和照射复合创伤组 (照射组 ) ,用免疫组织化学、原位RT PCR和图像分析方法检测两组伤口伤后 1～ 6 0d各时间点PDGF A、PDGFR α蛋白及PDGF AmRNA的表达规律。结果 局部照射使伤口愈合各阶段滞后、延长。对照组伤口成纤维细胞PDGF A和PDGFR α表达有明显的时相性 ,PDGF A在伤后 2～ 2 1d可见表达 ,5d为表达高峰 ;照射组在伤后各时间点其表达均减弱 ,且表达时相延长 ,伤后 2 8d仍有表达 ;PDGFR α在对照组于伤后 2～ 15d有表达 ,5d时达高峰 ,照射组PDGFR α表达减弱 ,但其表达时相与对照组一致。结论 照射抑制伤口成纤维细胞内源性PDGF A及PDGFR α的表达 ,表明照射使成纤维细胞自分泌PDGF A功能减弱并对外源性PDGF A的反应性减弱 ,进而导致伤口愈合延迟。

银屑病患者骨髓基质细胞分泌EGF、PDGF-A和PDGF-B水平研究

目的通过比较银屑病患者与对照组骨髓基质细胞分泌表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子-A(PDGF-A)和血小板源性生长因子-B(PDGF-B)水平的差异,揭示银屑病患者骨髓造血微环境的异常。方法采用密度梯度离心法分离患者与对照组骨髓单一核细胞,通过贴壁法培养骨髓基质细胞,收集传3代后又培养72h的骨髓基质细胞及培养上清,用流式细胞仪鉴定细胞表面标志并用ELISA法检测上清液中EGF、PDGF-A和PDGF-B的水平。结果90%以上细胞表面抗原高表达CD29,而CD34、CD45及HLA-DR表达阴性,即骨髓基质细胞纯度在90%以上;患者组骨髓基质细胞分泌EGF和PDGF-B均显著低于对照组(P<0.05),而PDGF-A的分泌水平两组间无统计学差异(P>0.05)。结论银屑病患者骨髓基质细胞分泌的某些细胞因子存在异常,表明患者骨髓造血微环境可能存在异常。

子痫前期和子痫患者胎盘和血浆PDGF-A表达及意义

目的比较正常妊娠和子痫前期、子痫患者胎盘组织血小板源性生长因子(PDGF)-A mRNA、PDGF-AA的表达和血浆PDGF-AA蛋白水平,探讨PDGF-A与子痫前期发病的关系。方法对子痫前期和子痫患者43例、正常妊娠20例,分别用RT-PCR检测胎盘绒毛组织PDGF-A mRNA表达水平,用免疫组化SABC法结合计算机显微图像分析软件,检测胎盘绒毛组织PDGF-AA蛋白的表达水平,用ELISA检测血浆中PDGF-AA蛋白表达水平。结果子痫前期、子痫组及正常妊娠组胎盘组织的PDGF-A mRNA和PDGF-AA蛋白表达,病例组均高于正常组,且与病情轻重呈正相关;病例组血清PDGF-AA蛋白水平均高于正常组,也与病情轻重呈正相关。结论子痫前期和子痫患者胎盘组织及血浆高度表达的PDGF-A可促进动脉粥样硬化形成,可能在子痫前期患者的胎盘血管病变中起重要作用,并参与子痫前期的发生和发展。

晚期糖化终产物对离体血管平滑肌细胞的影响

目的 :探讨晚期糖化终产物 (AGEs)对离体新生牛胸主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC)的影响及机制。 方法 :观察VSMC受 AGEs刺激后其生长、超微结构和血小板源生长因子 - A(PDGF- A)的变化以及维生素 E对上述变化的影响。结果 :AGEs促进 VSMC生长 ,细胞内 AGEs和 PDGF- A的免疫反应呈阳性 ,线粒体和粗面内质网增多。维生素 E不阻断 VSMC对AGEs的摄取 ,但能抑制 AGEs的细胞效应。 结论 :AGEs对 VSMC有直接效应 ,氧化应激可能参与了 AGEs的细胞效应。

参麦注射液对大鼠脑出血后迟发性神经细胞损伤的保护作用

目的:观察参麦注射液对大鼠脑出血后迟发性神经细胞损伤的保护作用。方法:采用Rosenberg法复制大鼠脑出血模型,观察脑出血后大鼠海马CA1区神经细胞病理形态结构、神经细胞线粒体DNA缺失、C-myc基因、PDGFA基因表达及参麦注射液的防治作用。结果:参麦注射液减少大鼠脑出血后海马CA1区锥体细胞凋亡数目,抑制血肿周围脑组织线粒体DNA片段缺失,参麦注射液对出血早期C-mycmRNA的表达无明显影响,但可使PDGFAmRNA表达明显下调并时限延长。结论:参麦注射液可能通过调节PDGF表达对脑出血后迟发性神经细胞损伤修复有保护作用。