从江香猪PDK4基因干扰载体的构建与检测

为了进一步揭示PDK4基因在猪肌内前体脂肪细胞中的调控作用,本试验采集5日龄从江香猪背最长肌,采用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离肌内前体脂肪细胞,进行原代和传代培养及形态学观察;根据克隆得到的PDK4基因序列,利用在线软件设计合成3对特异性单链siRNA序列和1对阴性对照序列,经退火后形成双链,连接pLVX-shRNA2-Puro载体,重组质粒采用双酶切及测序进行验证。针对干扰载体转染培养的从江香猪肌内前体脂肪细胞,采用实时荧光定量PCR方法筛选出最有效的干扰序列。结果显示,原代从江香猪肌内前体脂肪细胞约4h开始贴壁,24h后细胞形态均一,贴壁牢固,第5天汇合呈单层细胞,基本铺满培养板;重组质粒经双酶切及测序鉴定结果显示,设计合成的4对siRNA干扰序列与载体质粒均连接正确,表明成功构建了PDK4基因的干扰载体,并可成功转染猪肌内前体脂肪细胞;实时荧光定量PCR方法检测发现,干扰载体可有效减少从江香猪肌内脂肪前体脂肪细胞中PDK4基因mRNA的表达,最佳干扰效率可达81.90%。本试验成功培养了从江香猪肌内前体脂肪细胞,构建并得到了PDK4基因的最佳干扰载体,为进一步研究PDK4基因对脂肪代谢的调控机制奠定基础。