2型糖尿病大鼠胰岛β细胞PDX-1基因表达及GLP-1的干预作用

目的:观察胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)类似物利拉鲁肽对2型糖尿病大鼠胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)基因表达水平的影响。方法:将60只雄性SD大鼠平均分为3组:正常对照组、糖尿病未治疗组及GLP-1组,正常对照组给予普通饲料喂养,糖尿病未治疗组与GLP-1组给予高脂饲料喂养,于第8周末以链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)30 mg/(kg·bw)腹腔注射高脂饲料喂养组,成模后GLP-1组给予利拉鲁肽200μg/kg皮下注射,每日2次共持续8周。其余2组予等量的生理盐水皮下注射。以实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real-Time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,Real-Time RT-PCR)法检测大鼠胰腺胰岛细胞PDX-1基因的表达。结果:与正常对照组比较,GLP-1组及未治疗组PDX-1 mRNA的表达量明显减低(P<0.001),GLP-1治疗后2型糖尿病大鼠胰腺PDX-1 mRNA的表达量可明显增高(P<0.001)。结论:GLP-1可上调2型糖尿病大鼠胰岛β细胞PDX-1基因的表达。

PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用

【目的】探讨PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用。【方法】将C2C12细胞分别经过不同浓度的类胰高血糖素(GLP-1)诱导120h后,瞬间转染胰腺十二指肠同源框(PDX-1)基因,用RT-PCR检测PDX-1的表达,流式细胞仪、放射免疫法检测细胞内和培养基中是否存在胰岛素。【结果】GLP-1可以直接诱导C2C12细胞表达PDX-1;PDX-1瞬时转染C2C12细胞后,胰岛素分泌细胞阳性率比值(1.19±0.10)、培养基中的胰岛素含量(2.45±1.48)×10-6U/mL均明显升高(P<0.05);单独的40nmol/LGLP-1诱导与瞬间转染PDX-1相比,阳性率比值及胰岛素浓度的差别均无统计学意义。【结论】GLP-1可以诱导C2C12表达PDX-1,而且PDX-1可以促进C2C12分泌胰岛素。提示GLP-1诱导C2C12分化为胰岛素分泌细胞可能与PDX-1有关。

重构腺相关病毒转导PDX-1对C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用

【目的】重构含有PDX-1的腺相关病毒载体,将PDX-1转导入C2C12细胞,观察胰岛素分泌量的改变。【方法】应用PCR方法将PDX-1从pZL1质粒中克隆出来,安装到Stratagene公司的腺相关病毒(AAVHelper-FreeSystem)表达系统中,转染HEK293细胞,培养72h,提取病毒悬液,转导PDX-1进入C2C12细胞中,检测细胞培养液中的胰岛素含量。【结果】①用X-gal染色系统检测,可见有蓝色的阳性细胞。②病毒的粗略的浓度经计算后大约为1012/mL,转导的病毒数约为1011。③PCR结果:用重构的腺相关病毒转导后C2C12有胰岛素及PDX-1的mRNA的表达。④用重构的腺相关病毒转导PDX-1进入C2C12后的培养液的胰岛素浓度为(5.5±1.1)μIU/mL,较其他方法也有较明显的增加(P<0.05)。【结论】通过应用含有PDX-1基因的重构腺相关病毒载体可以转导PDX-1在C2C12细胞中表达,且可以提高C2C12分化为胰岛素分泌细胞的分泌量。

胰腺十二指肠同源框基因PDX-1的体外扩增

目的提取大鼠胰岛细胞瘤细胞株的RNA,以其中的mRNA为模板,扩增胰腺十二指肠同源框-1(PancreaticDuodenalHomeobox-1)编码基因,并测定核苷酸序列,为进一步克隆及表达PDX-1cDNA奠定基础。方法采用TIZOL方法进行RNA提取;通过RT-PCR方法扩增大鼠PDX-1cRNA;琼脂糖凝胶电泳检测后进行序列测定。结果从大鼠胰岛细胞瘤细胞中提取了RNA,以其中的mRNA为模板扩增出大鼠PDX-1基因,经琼脂糖凝胶电泳鉴定为目的片断,经序列测定与Genebank公布的序列一致。结论在国内首次成功的克隆了PDX-1基因。扩增时在5'端以限制性酶切位点进行限制,对进一步进行其克隆、表达研究以及对其生物学功能进行研究奠定了基础。

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的:克隆小鼠pdx-1基因,构建其真核表达载体,并在小鼠胚胎干细胞中表达,为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法:PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组,将pdx-1基因cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点,形成重组载体pEGFP/pdx-1,转化大肠杆菌DH5α菌株,构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA,HindⅢ和BamHⅠ酶切,电泳,DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果:从小鼠胰腺cDNA扩增出876bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为pdx-1基因,插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13,24h后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论:小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功,为进一步研究其功能奠定了基础。

PDX-1及其对胰岛β细胞的调控作用

胰腺十二指肠同源盒(PDX-1)具有促进胰岛β细胞增殖以及抑制其凋亡的作用。PDX-1通过调控胰岛素及胰岛素相关基因如葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖转运蛋白(GLUT2)等的表达,促进胰岛素分泌,维持胰岛β细胞的正常功能。提高胰岛β细胞PDX-1蛋白表达量,可对抗因“糖毒性”所致的胰岛β细胞功能损伤,促进胰岛素基因表达。PDX-1还可以将非胰岛素分泌细胞如肝细胞等转化为胰岛素分泌细胞。

高浓度葡萄糖对PDX-1表达和胰岛素分泌功能的影响

目的探讨高浓度葡萄糖(Glu)对PDX-1表达的影响及其与胰岛素(Ins)分泌的关系。方法分别测定SD大鼠胰岛细胞基础和Glu刺激后Ins分泌量、细胞内Ins含量、细胞内PDX-1mRNA和蛋白的表达水平。结果1·高糖刺激3天后,基础和Glu刺激后Ins分泌量、细胞内Ins含量及PDX-1蛋白表达水平均明显降低(P<0·01)。2·在高糖环境下,延长培养时间可显著加强高糖对PDX-1蛋白表达的抑制作用。3·纠正高糖环境3天后可部分逆转高糖对PDX-1蛋白表达的抑制作用。结论高浓度Glu对PDX-1蛋白表达的抑制是Glu毒性作用的机制之一,纠正高糖3天后可部分逆转高糖对PDX-1蛋白表达的抑制作用,恢复Ins分泌功能。

氧化应激对2型糖尿病大鼠胰岛PDX-1表达的影响

目的:探讨氧化应激对2型糖尿病大鼠胰岛胰岛素的生物合成及分泌功能的影响。方法:检测正常Wistar大鼠及2型糖尿病大鼠血清的空腹血糖、餐后血糖及空腹胰岛素,并测定胰腺组织匀浆丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量;应用免疫组化法检测胰岛PDX-1、胰岛素的表达。结果:①糖尿病组大鼠胰腺匀浆MDA、NO含量升高,SOD、GSH-PX降低,胰岛PDX-1、胰岛素表达降低,与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);②胰岛PDX-1的表达与MDA、NO呈负相关,与SOD、GSH-PX呈正相关(P<0.05)。结论:2型糖尿病大鼠胰腺存在氧化应激反应,可引起2型糖尿病大鼠胰岛PDX-1、胰岛素的表达下降,直接影响胰岛素的生物合成及分泌。

pdx-1基因克隆及其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

背景与目的克隆小鼠胰十二指肠同源框-12(PEGFP-C1pdx-1)基因,并构建pdx-1的表达载体。材料与方法通过RT-PCR方法从小鼠胰腺总RNA中克隆pdx-1基因,并将该基因构建到pEGFP-C1和pcDNA3.0中获得pdx-1的表达载体。通过观察荧光和RT-PCR方法检测表达载体转染SMMC-7721后pdx-1基因在细胞中的表达。结果克隆了883bp的pdx-1全长cDNA,成功构建了pEGFP-C1pdx-1和pcDNA3pdx-1两种表达载体。pEGFP-C1pdx-1转染SMMC-7721后,可观察到绿色荧光仅局限于细胞核中;通过RT-PCR方法在转染后的细胞中都检测到了pdx-1基因的转录。结论pdx-1表达载体的构建为进一步研究pdx-1基因在胰腺发育和肝干细胞增殖与分化方面的作用奠定了基础。

腺病毒载体介导PDX-1在骨髓间充质干细胞中的表达

为研究PDX 1基因在骨髓间充质干细胞中的表达情况及生物学功能的发挥 ,构建了含PDX 1基因的重组腺病毒载体 .酶切PDX 1基因并连入穿梭质粒 pAdTrack CMV .用电穿孔法使穿梭质粒pAdTrack CMV PDX 1与病毒骨架质粒 pAdEasy 1在大肠杆菌BJ5 183中同源重组 .利用脂质体介导重组腺病毒载体转染 2 93细胞 ,包装出完整的腺病毒 .分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞 .用重组腺病毒感染间充质干细胞 .用荧光显微镜、RT PCR、免疫荧光染色等方法检测PDX 1、胰岛素基因及蛋白质的表达 ,用放射免疫分析法检测转基因细胞分泌胰岛素情况 .结果表明 :通过测序、PCR、酶切等鉴定PDX 1基因已正确插入穿梭质粒中 ,并与病毒骨架质粒重组 .重组腺病毒滴度为 6 3× 10 7PFU/ml.通过荧光显微镜观察证实重组腺病毒可高效感染骨髓间充质干细胞 ,经RT PCR、免疫荧光染色证实转染 pAd PDX 1后培养 7天的细胞中有PDX 1及胰岛素基因的表达 .这些转基因的细胞向胞外分泌的胰岛素量为 (15 2 1± 3 5 0 )mIU/L .

PDX-1、β-连接素在乳腺癌中表达及预后关系的临床研究

目的观察乳腺癌组织中人胰腺同源盒-1(Pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)、β-连接素(β-catenin)蛋白和mRNA的表达情况,探讨其关系及临床意义。方法收集200例乳腺癌标本作为实验组,50例正常乳腺组织作为对照组,应用免疫组织化学技术检测二组中PDX-1和β-catenin蛋白的表达,应用real time PCR技术检测二组中PDX-1和β-catenin mRNA的表达,探讨其关系及临床意义。结果乳腺癌中PDX-1、β-catenin蛋白表达的阳性率明显高于正常乳腺组织,PDX-1和β-catenin蛋白的表达与分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关;乳腺癌中PDX-1、β-catenin mRNA的表达量明显高于正常乳腺组织,PDX-1、β-catenin蛋白和mRNA的表达均与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关;相关分析显示PDX-1和β-catenin蛋白呈正相关,PDX-1和β-catenin mRNA呈正相关;生存分析显示PDX-1、β-catenin蛋白和mRNA的表达均与患者的生存密切相关。结论 PDX-1、β-catenin蛋白和mRNA在乳腺癌中异常表达,PDX-1和β-catenin可能具有协同作用,进而促进肿瘤的发生发展,术后联合检测PDX-1、β-catenin蛋白和mRNA的表达可能对判断乳腺癌的预后有重要意义。

PDX-1基因与糖尿病治疗

胰腺 十二指肠同源框 1(pancreaticduodenalhomeobox 1,PDX 1) ,是在胰腺发育中起重要作用的转录因子 ,它可以调节胰岛素在胰岛 β细胞中的表达 ,并可特异性激活基因的转录。葡萄糖、激素等物质可调节PDX 1基因的表达。Ⅰ型及部分Ⅱ型糖尿病是由于胰腺 β细胞凋亡异常增多而使得 β细胞数目减少 ,致使胰岛素分泌不足而引起的 ,与胰岛素分泌相关的PDX 1基因在治疗糖尿病方面的研究表现出了巨大的潜力。

枸杞多糖对2型糖尿病大鼠胰腺β细胞PDX-1基因表达的实验研究

目的探讨枸杞多糖对2型糖尿病大鼠β细胞分泌功能及PDX-1基因mRNA表达的影响。方法用高糖饲喂并结合链脲佐菌素诱导制备2型糖尿病大鼠模型,分组灌胃给予不同浓度的枸杞多糖及对照药物,50只实验动物随机分为5组:对照组、模型组、模型+30mg/kgLBP组、模型+60mg/kgLBP组、模型+90mg/kgLBP组。连续8周后检测空腹血糖、三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清胰岛素,处死大鼠取胰腺组织,RT-PCR检测β细胞内PDX-l及胰岛素mRNA的表达水平。结果 2型糖尿病大鼠胰腺β细胞PDX-l及胰岛素mRNA的表达水平显著下降(P<0.01);60mg/kg和90mg/kgLBP组能显著上调2型糖尿病大鼠胰腺β细胞PDX-l与胰岛素mRNA表达水平(P<0.05)。结论 LBP可以通过上调PDX-l和胰岛素mRNA表达,改善2型糖尿病大鼠β细胞胰岛素合成和分泌功能的损伤。

脐血干细胞对1型糖尿病大鼠血糖及PDX-1、MafA表达水平的影响

背景:1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,以胰腺β细胞选择性破坏,导致患者体内胰岛素分泌绝对不足为特征。脐血干细胞具有多分化潜能,在体内外均可以诱导分化为胰岛细胞,发挥出一定的降糖作用。目的:探讨脐血干细胞对1型糖尿病大鼠血糖水平及胰腺组织PDX-1、Maf A表达的影响。方法:30只SD大鼠随机分为3组,每组10只,治疗组和模型组大鼠建立1型糖尿病模型,造模成功后,治疗组尾静脉一次性注射脐血干细胞,正常组给予相同体积的生理盐水,模型组给予相同体积的脐血干细胞缓冲液。采用口服葡萄糖耐量试验评价大鼠胰岛功能,苏木精-伊红染色观察大鼠胰腺形态,Western blot和PCR检测胰腺组织PDX-1、Maf A蛋白和m RNA表达。结果与结论:1模型组和治疗组大鼠0,30,60,90 min的血糖值均显著高于正常组,差异均有显著性意义(P<0.05);120 min时间点模型组血糖值显著高于正常组(P<0.05);治疗组则与正常组之间差异无显著性意义(P>0.05)。2模型组胰岛数量出现下降,边界模糊不清,呈不规则形态,治疗组胰岛数量出现一定的减少,但尚维持清晰的结构。3治疗组PDX-1及Maf A表达水平与正常组比较差异无显著性意义(P>0.05),但显著高于模型组(P<0.05)。以上结果表明,脐血干细胞可以显著降低1型糖尿病大鼠的血糖水平,改善胰岛功能及胰腺组织形态,并具有上调PDX-1、Maf A表达的作用。

利拉鲁肽对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡及PDX-1表达的影响

胰腺十二指肠同源基因1（PDX-1）的活化被认为是胰岛素分泌和葡萄糖代谢的一个关键调节剂[1],PDX-1受胰高糖素样肽-1（GLP-1）的调节。然而以往及我们的临床研究显示,初发及长病程2型糖尿病患者血GLP-1的水平均下降并呈现不同程度的胰腺β细胞功能受损[2]。

不同纯度携带干细胞胰岛转分化培养前、后PDX-1的表达研究

用不同纯化方法获取3种不同浓度大鼠胰岛,分离并转分化胰腺干细胞.用兔抗鼠PDX-1多克隆抗体鉴定胰腺干细胞,用免疫细胞化学、RT-PCR方法检测转分化前后胰腺干细胞PDX-1的表达.结果显示胰腺干细胞经转分化后PDX-1蛋白在胞核表达明显增多,并且转分化后PDX-1mRNA表达也增多.这说明胰腺干细胞经转分化培养后的子代细胞仍然保持干细胞的特征.

一步法实时荧光定量PCR检测大鼠胰腺组织中Insulin mRNA和PDX-1 mRNA的表达

目的通过检测大鼠胰腺组织中Insulin mRNA和PDX-1 mRNA的表达探讨EGF/Gastrin联用促进胰岛PDX-1表达增强可能的作用机制。方法采用一步法实时荧光定量PCR检测各组大鼠胰腺组织中Insulin基因和PDX-1基因在转录水平的表达。结果大鼠胰腺组织中Insulin mRNA在转录水平的表达情况正常对照组最高;糖尿病组最低,与正常对照组相比相差2.4倍(P<0.05);EGF/Gastrin组是糖尿病组的2.1倍(P<0.05)。大鼠胰腺组织中PDX-1mRNA在转录水平的表达情况正常对照组最高,糖尿病组最低,与正常对照组相比相差2.8倍(P<0.05),EGF/Gastrin组是糖尿病组的2.2倍(P<0.05)。结论 EGF/Gastrin联用促进胰岛PDX-1表达增强的作用机制可能通过其改善胰岛β细胞功能、降低血糖进而减弱糖毒性对PDX-1表达的不良影响,间接地使PDX-1的表达增强。而EGF/Gastrin联用促进胰岛新生、改善胰岛β细胞功能又有可能是通过提高PDX-1的表达而实现的。

pEGFP-PDX-1真核表达载体的构建

目的:构建真核表达载体pEGFP-PDX-1,为基因水平研究PDX-1在肝干细胞定向分化中的调控机制提供理论参考。方法:参考分子克隆技术,采用PCR的方法从SK900/BLSCR IPT质粒中扩增PDX-1,同时将一个单个限制性酶切位点连接反应转变为以H indⅢ和BamHⅠ为末端的双限制性内切酶位点连接反应,将PDX-1 cDNA定向插入pEGFP-C1的多克隆位点中,构建重组表达质粒pEGFP-C1-PDX-1,并对重组子进行Sm aⅠ单个限制性内切酶酶切鉴定。结果:构建了含有PDX-1 cDNA的真核表达载体pEGFP-PDX-1。结论:将PDX-1插入pEGFP-C1的C-末端,提高PDX-1在真核细胞中的表达,而且不影响其目的蛋白的结构和功能,对研究PDX-1调控肝干细胞的定向分化机制具有重要的意义。

小鼠不同细胞间表观遗传修饰的变化对Pdx-1基因转录表达的影响

目的:通过比较小鼠不同细胞类型之间Pdx-1基因转录起始区的表观遗传修饰差异,探讨表观遗传修饰对Pdx-1基因转录表达的作用。方法:采用免疫共沉淀-实时定量PCR法检测小鼠胚胎干细胞(mES)、小鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞和小鼠β细胞株NIT-1细胞Pdx-1和MLH1基因转录起始区DNA甲基化和组蛋白修饰(H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化)的状况。同时采用实时定量RT-PCR检测上述3种细胞各基因mRNA表达水平。分析基因的DNA甲基化水平、H3K4m3、H3K9m3和H3乙酰化修饰与基因表达之间的相互关系。结果:(1)以mES细胞为对照,NIT-1细胞的Pdx-1基因转录起始区呈低DNA甲基化和高H3K4m3修饰(P<0.05),NIH3T3细胞的Pdx-1基因的转录起始区的DNA甲基化、H3乙酰化、H3K4m3和H3K9m3修饰水平明显增高(P<0.05);(2)Pdx-1基因仅在NIT-1细胞表达,其表达与DNA甲基化存在等级负相关(r=-0.802,P<0.01),与H3K4m3修饰存在直线相关(r=0.997,P<0.01),与H3K9m3修饰存在等级负相关(r=-0.879,P<0.01);(3)管家基因MLH1的表达与所检测的表观遗传修饰无相关性。结论:DNA甲基化、H3K9m3与H3K4m3修饰能相互协调,共同调控Pdx-1基因的表达,对胚胎干细胞向β细胞分化具有重要意义。