大鼠PDZ1-FLAG的亚克隆及pcDNA3.1载体的构建

目的亚克隆大鼠PDZ1-FLAG基因片段并构建pcDNA3.1载体。方法以pAdTrack-CMV-PDZ1为模板,采用PCR法获得PDZ1-FLAG的双链DNA;与pcDNA3.1载体用T4DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果①得到了PDZ1-FLAG的双链DNA;②酶切鉴定能观察到PDZ1-FLAG和pcDNA3.1两条带;③PDZ1-FLAG测序图谱与文献报道完全一致。结论获得了含目的基因PDZ1-FLAG的pcDNA3.1载体。

紧密连接蛋白ZO-1 PDZ结构域的研究进展

自然界的生物过程常常需要特定的蛋白质间相互作用来实现,而这些相互作用大多数是通过结构域来实现的。结构域是蛋白质的基本结构和功能单位,是蛋白质中具有特异结构和独立功能的区域,

PDZK1通过PDGFR-β通路对胃癌发生发展的影响

胃癌占癌症死亡原因的第2位，胃癌本身的生物学特性差异导致治疗结果和预后的显著不同，决定胃癌发生、发展及生物学特性的机制是临床医师非常关注的问题。而血小板源性生长因子受体一B（PDGFR—β）是研究热点之一，PDGFR—β过度激活和异常表达能诱导肿瘤新生血管的生成、促进肿瘤的生长；还可降解细胞外基质，使细胞表面黏附分子减少，直接或问接参与了肿瘤的侵袭与转移。PDZ蛋白激酶1（PDZK1）可与PDGFR—β特异性结合，而影响PDGFR—β的下游的三条信号传导通路（Ras—MAPK信号通路、P13K-Akt信号通路、PLC信号通路），进而影响多细胞的增生、分化和迁移。

白细胞介素-37通过重组人PDZ区域含1蛋白影响痛风发病的作用机制研究

目的探讨痛风发病的分子病理机制,通过初步研究验证并揭示IL-37通过NF-KB通路影响痛风发病中重组人PDZ区域含1蛋白(PDZK1)的作用机制。方法使用炎症信号IL-37刺激HK-2细胞,分别对IL-37(A组)、PDTC+IL-37(B组)、Wortmannin(PI3K通路抑制剂)+IL-37(C组)0、5、10、20、40 ng/ml浓度处理条件下通过实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)检测PDZK1 mRNA表达水平,检测PDZK1蛋白表达水平,用细胞免疫荧光检测PDZK1表达情况及其亚细胞定位。加入抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)(NF-κB通路抑制剂)或者Wortmannin再加入炎症信号刺激蛋白印迹法检测HK-2细胞PDZK1蛋白表达量的变化,组间均采用t检验进行统计学分析。结果PDZK1 mRNA水平分别为[A组(28.71±0.35,28.57±0.31,28.78±0.28,28.63±0.29,28.62±0.19);B组(28.71±0.31,28.83±0.27,28.58±0.26,28.73±0.36,28.68±0.35);C组(28.81±0.32,28.91±0.29,28.72±0.24,28.59±0.18,28.58±0.22)],A组与B组(t=5.73,4.72,4.69,5.86,6.79),A组与C组(t=6.78,7.13,7.47,6.38,5.98)相比差异均无统计学意义(P>0.05)。3组通过蛋白质印迹法分析PDZK1蛋白水平分别为[A组(0.200±0.082,0.412±0.032,0.723±0.063,1.202±0.021,1.222±0.023);B组(0.124±0.064,0.303±0.081,0.325±0.062,0.223±0.071,0.343±0.052);C组(0.017±0.022,0.204±0.015,0.187±0.053,0.302±0.051,0.404±0.051)],A组用不同浓度的IL-37处理后PDZK1蛋白水平随着IL-37浓度的增加而增加;B组的PDZK1蛋白水平随着IL-37浓度的增加而增加,但其蛋白的水平比仅用IL-37处理的组别要低,在IL-37浓度为40 ng/ml时出现了下降的趋势;C组PDZK1蛋白水平随着IL-37浓度的增加而增加,但其蛋白的水平比仅用IL-37处理的组别要低,A、B2组差异无统计学意义(t值分别为1.83,1.37,1.64,1.57,1.49,P>0.05);A、C 2组差异无统计学意义(t值分别为1.28,1.37,1.26,1.42,1.39,P>0.05)。免疫荧光结果分析:3组结果与蛋白质印迹法结果的趋势基本吻合。结论IL-37通过PDZK1蛋白导致痛风发病作用机制可能不是发生在转录水平,很可能发生在蛋白质翻译水平。

PDZ连接激酶诱导自噬对肺癌细胞顺铂化疗敏感性的影响研究

目的探究PDZ连接激酶(PBK)对肺癌细胞顺铂化疗敏感性的作用及其相关的作用机制。方法A549细胞用顺铂处理或者是转染si-NC、si-PBK、si-亲嗜性病毒整合位点-1(EVI1)、oe-NC和oe-EVI1。RT-qPCR检测人肺癌细胞株A549、HCC827、NCI-H1299和人正常肺上皮细胞BEAS-2B中EVI1和PBK mRNA表达;Western blot检测细胞中EVI1、PBK、Beclin1、p62和微管相关蛋白1轻链3(LC3B)蛋白表达;CCK-8检测细胞活力;EdU实验检测细胞增殖;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;ChIP-PCR实验检测细胞中EVI1和PBK启动子区域的结合。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较(EVI1及PBK表达情况只比较HCC827组与BEAS-2B组、NCI-H1299组与BEAS-2B组、A549组与BEAS-2B组)采用LSD-t检验。si-NC组和si-EVI1、oe-NC组和oe-EVI1组PBK的表达情况采用独立样本t检验进行比较。结果与BEAS-2B细胞相比,HCC827、NCI-H1299和A549细胞中EVI1和PBK mRNA表达以及蛋白表达均升高,差异具有统计学意义(P均<0.05)。与空白对照组相比,顺铂组和顺铂+si-NC组细胞中EVI1和PBK mRNA表达以及蛋白表达均升高,Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达(0.15±0.01比0.36±0.02、0.34±0.02)(1.32±0.11比4.16±0.21、4.04±0.15)均升高,差异具有统计学意义(P均<0.05);与空白对照组相比,顺铂组、顺铂+si-NC组及顺铂+si-PBK组细胞24、48、72 h细胞活力降低,EdU阳性细胞率[(42.71±2.56)﹪比(30.25±1.91)﹪、(28.90±2.51)﹪]、迁移数[(133.67±6.51)个比(72.00±4.00)个、(70.00±2.65)个]、侵袭数[(81.00±4.00)个比(43.00±3.00)个、(42.00±3.00)个]、p62蛋白表达(0.65±0.03比0.22±0.02、0.23±0.01)均降低,差异具有统计学意义(P均<0.05)。与顺铂组和顺铂+si-NC组相比,顺铂+si-PBK组细胞中PBK mRNA和蛋白表达降低,24、48、72 h细胞活力降低,EdU阳性细胞率[(30.25±1.91)﹪比(28.90±2.51)﹪、(22.25±1.97)﹪]、迁移数[(72.00±4.00)个、(70.00±2.65)个比(34.00±3.00)个]、侵袭数[(43.00±3.00)个、(42.00±3.00)个比(21.33±2.52)个]、Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达(0.36±0.02、0.34±0.02比0.25±0.02)(4.16±0.21、4.04±0.15比2.45±0.22)均降低,差异具有统计学意义(P均<0.05);p62蛋白表达(0.22±0.02、0.23±0.01比0.46±0.02)升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。EVI1通过直接与PBK启动子区域结合,与si-NC组相比,si-EVI1组细胞中EVI1 mRNA和蛋白表达降低,PBK mRNA和蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P均<0.05);与oe-NC组相比,oe-EVI1组细胞中EVI1和PBK mRNA和蛋白表达升高,差异具有统计学意义(P均<0.05)。结论受EVI1调节的PBK可能通过促进自噬抑制肺癌细胞对顺铂的化疗敏感性。