结核分枝杆菌PPE家族蛋白CD4^+ T细胞泛宿主表位的计算机预测及其γ干扰素释放实验研究

目的利用计算机预测结核分枝杆菌PPE家族蛋白MHC-II类分子限制性CD4+T细胞泛宿主表位,并利用γ干扰素释放实验进行体外验证。方法利用网上数据库提取PPE家族全部蛋白序列。使用生物信息学软件包括Signal P4.1,Secretome P 2.0,DAS和Net MHCII2.2等分析工具预测、筛选出MHC-II类分子限制性CD4+T细胞泛宿主表位。最后利用γ干扰素释放实验进行合成肽段的体外实验验证其刺激激活CD4+T细胞的能力。结果发现了34个泛宿主表位多肽,其中21个来自于PPE8蛋白,其余来自于PPE12、PPE21和PPE62蛋白。γ干扰素释放实验并未发现预测出的泛宿主表位多肽可刺激大量的CD4+T淋巴细胞产生IFN-γ的分泌,但来自于PPE8蛋白的两个泛宿主表位多肽可刺激少量的CD4+T淋巴细胞产生反应。结论这些计算机预测出来的泛宿主表位多肽,尤其是来自PPE8蛋白的泛宿主表位多肽,可能是下一步亚单位疫苗或诊断性标志物的重要候选抗原。但仍需进一步扩大样本量进行验证。

结核分枝杆菌PE22/PPE36融合蛋白对耻垢分枝杆菌表型及巨噬细胞功能影响的研究

目的将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)PE/PPE家族重组融合蛋白PE22/PPE36异源表达于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)后,探讨其对Ms表型及巨噬细胞功能的影响,分析其在Mtb感染过程中发挥的作用。方法原核表达获取融合蛋白PE22/PPE36,纯化后免疫6~8周龄小鼠制备多克隆抗体;电击法构建重组菌Ms_PE22/PPE36及Ms_vec,并用所制备的多克隆抗体验证重组融合蛋白在Ms中的表达。将重组菌接种于2×YT培养基中观察其菌落形态及生长曲线;点板法及菌落计数法检测重组菌在H_(2)O_(2)、SDS、溶菌酶、NaNO_(2)、低pH、饥饿等压力条件下的存活情况,以分析PE22/PPE36融合蛋白对Ms表型的影响;重组菌侵染巨噬细胞ANA-1及RAW 264.7后,流式细胞术检测ANA-1细胞凋亡率,ELISA法检测ANA-1细胞TNF-α及IL-6分泌量,Griess法检测ANA-1及RAW 264.7细胞NO分泌量并用通道抑制剂检测所涉及的通路,菌落计数法检测重组菌在ANA-1及RAW 264.7细胞内的存活情况。结果与Ms_vec组相比,Ms_PE22/PPE36的菌落形态、生物膜形成及在溶菌酶、NaNO_(2)、低pH等压力条件下的存活率差异无统计学意义(溶菌酶:t 3 h=0.082,t 6 h=0.174,t 9 h=0.355;NaNO_(2):t 3 h=0.950,t 6 h=1.274;低pH:t 3 h=1.869,t 6 h=1.119,t 9 h=0.091;均P>0.05);在H_(2)O_(2)、SDS压力条件下存活率明显降低(H_(2)O_(2):t 6 h=4.35,t 8 h=4.80;SDS:t 4 h=10.43,t 6 h=2.793;均P<0.05);而稳定期生长速率及在饥饿压力条件下的存活率明显增高(生长速率:t 30 h=5.39,t 36 h=2.55,t 42 h=3.48;饥饿:t=3.323;均P<0.05);与Ms_vec感染组相比,Ms_PE22/PPE36组ANA-1细胞的早期凋亡率及TNF-α分泌量明显增加(早期凋亡:F=4.765;TNF-α:t 24 h=26.642,t_(48)h=7.634;均P<0.05),IL-6分泌量明显减少(t 24 h=5.888,t_(48)h=3.001;均P<0.05),ANA-1及RAW264.7细胞NO分泌量明显增加(ANA-1:F_(12)h=163.267,F_(24)h=111.530,F 48 h=500.328;RAW 264.7:F_(12)h=133.202,F_(24)h=718.436,F 48 h=1434.9;均P<0.05),且可被通道抑制剂Bay 11-7082、U0126及SB203580明显抑制(ANA-1:t NF-κB=32.074;t ERK=11.679;t p38=16.840;RAW 264.7:t NF-κB=119.112;均P<0.001);与Ms_vec相比,Ms_PE22/PPE36在ANA-1细胞内的存活率无明显变化(t_(48)h=0.327,t_(72)h=1.933,均P>0.05),在RAW 264.7细胞内的存活率明显降低(t_(48)h=5.509,t_(72)h=5.417;均P<0.05)。结论重组融合蛋白PE22/PPE36可改变Ms的表型并调控巨噬细胞的免疫应答。

结核分枝杆菌PE26蛋白调节巨噬细胞免疫反应进而促进分枝杆菌胞内定殖

结核分枝杆菌(MTB)PE/PPE家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用,调节宿主炎症反应,有助于其的存活和疾病发展。为研究PE/PPE家族中PE26蛋白的作用,本实验利用PCR扩增pe26基因片段,构建重组载体p AIN-PE26,转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p AIN-PE26/Ms,经western blot鉴定结果显示,p AIN-PE26/Ms正确表达重组PE26蛋白(rPE26)。利用差速离心分离p AIN-PE26/Ms亚细胞组分,经western blot鉴定结果显示,r PE26定位于p AIN-PE26/Ms细胞壁。通过p AIN-PE26/Ms的菌落形态观察和生长曲线测定,结果显示,p AIN-PE26/Ms菌体表面较p AIN/Ms对照组更粗糙,脊不规则且相对较高,褶皱不明显;p AIN-PE26/Ms生长速度较对照组极显著增加(P<0.001)。利用H37Ra感染巨噬细胞,通过q RT-PCR检测pe26转录水平,结果显示,H37Ra感染巨噬细胞后pe26转录水平极显著增加(P<0.001)。利用p AIN-PE26/Ms感染巨噬细胞,分别通过q RT-PCR、ELISA检测细胞因子转录和表达水平,采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验、流式细胞术和胞内定殖的方法检测细胞毒性,结果显示,p AIN-PE26/Ms促进宿主细胞炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α)的转录和表达(P<0.05);r PE26促进巨噬细胞死亡,且在感染48 h时促进细胞早期凋亡(P<0.05);r PE26促进p AIN-PE26/Ms在巨噬细胞内的定殖(P<0.01)。上述结果首次表明,定位于细胞壁的r PE26在感染巨噬细胞过程中促进p AIN-PE26/Ms的生长、炎性细胞因子的转录和表达、巨噬细胞凋亡和胞内定殖。本实验为解析PE26参与分枝杆菌的致病机制和MTB调节宿主免疫反应的机制提供一定参考依据。

结核分枝杆菌PE/PPE蛋白研究进展

PE/PPE蛋白是分枝杆菌所独有的蛋白家族,因其氨基端分别含有Pro-Glu(PE)和Pro-Pro-Glu(PPE)的基序而得名,其编码基因约占结核分枝杆菌整个基因组的10%。PE/PPE蛋白从被发现开始就引起了人们的广泛兴趣,本文就近年来的研究进展作一综述。

与结核分枝杆菌PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的宿主蛋白的筛选

为筛选与结核分枝杆菌(MTB)的PE25/PPE41和PE35/PPE68两对异源二聚体相互作用的宿主蛋白,本研究以这两对异源二聚体为诱饵蛋白筛选与其相互作用的宿主蛋白。首先将PCR扩增的PE25/PPE41或PE35/PPE68基因串联克隆于改造的pc DNA3.1(+)中(在5'端引入了以编码烟草蚀纹病毒蛋白酶切位点的序列连接的ZZ和Flag标签序列),构建诱饵重组质粒pcDNA-PE25-PPE41和pc DNA-PE35-PPE68。分别将构建的诱饵重组质粒转染293T细胞后提取细胞总蛋白,经ZZ和Flag标签蛋白两步串联亲和层析钓取宿主蛋白,SDS-PAGE电泳分离后切取差异蛋白胶条进行质谱分析,结果显示,PE25/PPE41鉴定到15个差异蛋白,PE35/PPE68鉴定到29个差异蛋白,并分别挑选了与PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的3个和7个差异蛋白,为进一步验证与PE25/PPE41和PE35/PPE68直接作用的宿主蛋白及研究其生物学功能奠定了基础。

结核分枝杆菌耐药机制研究进展和PE/PPE蛋白在介导细菌耐药中的作用

结核病是一种由结核分枝杆菌感染引起的,以空气传播为主的传染病,目前仍是全球公共卫生安全的重大威胁。随着抗结核抗生素的广泛使用,结核病的耐药问题也愈演愈烈,出现了多耐药结核、广泛耐药结核甚至完全耐药结核。对临床用抗结核药物作用机制和结核分枝杆菌对应耐药机制的研究,有利于我们开发新的抗结核药物,改造现有抗结核药物和研发新的耐药诊断技术。本文综述了近年来有关抗结核新药的作用机制及细菌耐药机制的研究进展,并特别讨论了最新发现的结核分枝杆菌外膜通道蛋白PE/PPE蛋白可能在结核分枝杆菌耐药中的重要作用,以期为后续的相关研究提供一定的参考。

结核分枝杆菌PE和PPE家族蛋白抗原性的生物信息学分析

目的应用生物信息学工具预测结核分枝杆菌PE和PPE家族的分泌性蛋白及分析其抗原性,减少抗原选择的盲目性,增加可靠性。方法应用多种生物信息学工具SignalP、SecretomeP、DAS、NetMHC等分析结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中PE和PPE家族成员的蛋白序列,找出可能的分泌性蛋白以及其抗原决定簇序列。结果在共168个PE和PPE家族成员中预测出23个可能的分泌性蛋白(PE家族20个,PPE家族3个),其中19个包含有与MHCⅠ和Ⅱ类分子高亲和力的肽段。结论结核分枝杆菌PE、PPE家族蛋白可以通过生物信息学工具分析预测其抗原性,辅助指导实验。

卡介苗中PE和PPE家族蛋白B细胞抗原表位多态性研究

目的了解13株卡介苗(bacille calmette-guérin,BCG)基因组中由PE/PPE基因家族编码的B细胞抗原表位分布情况,分析其对BCG免疫保护力的潜在影响。方法从国际免疫表位数据库(Immune Epitope Data base,IEDB)中检索结核分枝杆菌B细胞抗原表位,与结核分枝杆菌参考菌株H37Rv的蛋白质组进行序列比对,确定PE/PPE基因家族编码B细胞抗原表位序列;并与13株BCG基因组进行序列比对,提取表位编码序列,分析其在BCG中的分布与变异。结果 6个PE/PPE基因家族的基因编码28个B细胞抗原表位,21个B细胞抗原表位在13株BCG中高度保守,7个B细胞抗原表位在BCG中发生基因变异,变异表位分别产生于BCG的不同形成期。结论 PE/PPE基因家族所表达的蛋白大多为细菌表面蛋白,PE/PPE蛋白家族中B细胞抗原表位的变化可能对BCG的保护力产生影响,应继续开展基于B细胞表位的BCG遗传特征研究。

结核分枝杆菌蛋白Rv3425对细菌表型及毒力影响的研究

为探索蛋白Rv3425在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis)中的功能,本研究以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)为模式菌株,构建重组了耻垢分枝杆菌Ms-Rv3425。分别将构建菌株(Ms-Rv3425)、野生株(Ms)及空载对照(Ms-Pact)接种于7H9-OADC培养基中37℃培养,观察Ms-Rv3425与Ms及Ms-Pact之间在生长速率、菌落形态、生物膜以及聚集度方面的差异。分别用低pH值以及含有十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、氨苄西林、异烟肼及利福平的培养基进行培养,计算存活率以分析抗逆和抗药能力;用上述压力条件培养结核分枝杆菌标准株H37Ra,分析Rv3425内源表达量的变化;进行THP-1细胞感染和BALB/c小鼠攻毒实验分析菌株的毒性变化。结果显示,与Ms及Ms-Pact相比,Ms-Rv3425的菌落形态更为粗糙且隆起,成膜及聚集能力增强;在压力条件下,Ms-Rv3425表现出更高的抗逆和抗药能力,H37Ra中Rv3425的表达量也显著上调;胞内存活率及小鼠致死率更高,各脏器病理损伤更为严重。综上所述,过表达Rv3425能够改变耻垢分枝杆菌的表型,提高抗逆性、抗药性和毒力。深入探讨PPE家族蛋白Rv3425的功能,将为结核病的防治带来新的视角。

结核分枝杆菌特异PE/PPE蛋白家族研究进展

结核分枝杆菌(Mycobacterium. tuberculosis,MTB)是结核病的病原菌。富含甘氨酸的独特蛋白质家族——PE/PPE蛋白家族编码基因约占整个MTB菌基因组的10%,该蛋白家族可能是细菌毒力和抗原变异的主要来源,对其结构和生物学功能的研究将对结核感染的血清学诊断和结核菌苗的开发具有重要意义。

分枝杆菌PE／PPE蛋白家族的结构和功能

根据世界卫生组织提供的数据，2009年共有170万人死于结核病，全世界有20多亿人（约占世界总人口的1／3）感染MTB。过去对MTB确切的致病机制、毒力因子及其宿主与病原相互作用关系并不明确，MTB4．4Mb基因组测序的完成使上述问题有希望得到阐释。在MTB的H37Rv基因组中，约有10％的开放阅读框架编码一类N端含有特征基序的蛋白质，由于编码这类蛋白质基因数量庞大，且蛋白质结构特异，使其在MTB的生存、增殖和致病方面起重要作用。本文对该蛋白家族结构和功能的研究进展进行综述。一。

结核分支杆菌PPE蛋白质家族免疫原性初探

结核病(Tuberculosis,TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobactium tuberculosis,简称结核杆菌)感染引起的人畜共患慢性传染病,仍然是当今威胁人类健康的最主要疾病之一。结核病的传统诊断方法易受多种因素的干扰而产生较高的假阳性或假阴性结果,不利于结核病的早期确诊与治疗,发展新颖有效、灵敏度高和特异性强的诊断技术非常必要。

结核分枝杆菌PE和PPE家族研究进展

结核分枝杆菌的PE和PPE家族成员在结核分枝杆菌基因组中约占8％。且PE和PPE多基凶家族为分枝杆菌属所独有，在其他细菌基因组并未发现类似的如此庞大的多基因家族。对其序列结构、表达和调控的初步研究表明其成员可能表达于细胞表面，参与病原体与宿主间的相互作用，并且可能和结核分枝杆菌等致病分枝杆菌的抗原变异相关。一些家族成员蛋白或多肽可以诱导机体对结核分枝杆菌保护性的细胞免疫反应，是候选疫苗的成份。对其家族成员的各种研究在各个实验室里已广泛展开，本文就其研究现状作一综述。