结核分枝杆菌PE22/PPE36融合蛋白对耻垢分枝杆菌表型及巨噬细胞功能影响的研究

目的将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)PE/PPE家族重组融合蛋白PE22/PPE36异源表达于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)后,探讨其对Ms表型及巨噬细胞功能的影响,分析其在Mtb感染过程中发挥的作用。方法原核表达获取融合蛋白PE22/PPE36,纯化后免疫6~8周龄小鼠制备多克隆抗体;电击法构建重组菌Ms_PE22/PPE36及Ms_vec,并用所制备的多克隆抗体验证重组融合蛋白在Ms中的表达。将重组菌接种于2×YT培养基中观察其菌落形态及生长曲线;点板法及菌落计数法检测重组菌在H_(2)O_(2)、SDS、溶菌酶、NaNO_(2)、低pH、饥饿等压力条件下的存活情况,以分析PE22/PPE36融合蛋白对Ms表型的影响;重组菌侵染巨噬细胞ANA-1及RAW 264.7后,流式细胞术检测ANA-1细胞凋亡率,ELISA法检测ANA-1细胞TNF-α及IL-6分泌量,Griess法检测ANA-1及RAW 264.7细胞NO分泌量并用通道抑制剂检测所涉及的通路,菌落计数法检测重组菌在ANA-1及RAW 264.7细胞内的存活情况。结果与Ms_vec组相比,Ms_PE22/PPE36的菌落形态、生物膜形成及在溶菌酶、NaNO_(2)、低pH等压力条件下的存活率差异无统计学意义(溶菌酶:t 3 h=0.082,t 6 h=0.174,t 9 h=0.355;NaNO_(2):t 3 h=0.950,t 6 h=1.274;低pH:t 3 h=1.869,t 6 h=1.119,t 9 h=0.091;均P>0.05);在H_(2)O_(2)、SDS压力条件下存活率明显降低(H_(2)O_(2):t 6 h=4.35,t 8 h=4.80;SDS:t 4 h=10.43,t 6 h=2.793;均P<0.05);而稳定期生长速率及在饥饿压力条件下的存活率明显增高(生长速率:t 30 h=5.39,t 36 h=2.55,t 42 h=3.48;饥饿:t=3.323;均P<0.05);与Ms_vec感染组相比,Ms_PE22/PPE36组ANA-1细胞的早期凋亡率及TNF-α分泌量明显增加(早期凋亡:F=4.765;TNF-α:t 24 h=26.642,t_(48)h=7.634;均P<0.05),IL-6分泌量明显减少(t 24 h=5.888,t_(48)h=3.001;均P<0.05),ANA-1及RAW264.7细胞NO分泌量明显增加(ANA-1:F_(12)h=163.267,F_(24)h=111.530,F 48 h=500.328;RAW 264.7:F_(12)h=133.202,F_(24)h=718.436,F 48 h=1434.9;均P<0.05),且可被通道抑制剂Bay 11-7082、U0126及SB203580明显抑制(ANA-1:t NF-κB=32.074;t ERK=11.679;t p38=16.840;RAW 264.7:t NF-κB=119.112;均P<0.001);与Ms_vec相比,Ms_PE22/PPE36在ANA-1细胞内的存活率无明显变化(t_(48)h=0.327,t_(72)h=1.933,均P>0.05),在RAW 264.7细胞内的存活率明显降低(t_(48)h=5.509,t_(72)h=5.417;均P<0.05)。结论重组融合蛋白PE22/PPE36可改变Ms的表型并调控巨噬细胞的免疫应答。