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与结核分枝杆菌PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的宿主蛋白的筛选 被引量:1
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作者 李田田 陈利苹 刘思国 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期504-507,共4页
为筛选与结核分枝杆菌(MTB)的PE25/PPE41和PE35/PPE68两对异源二聚体相互作用的宿主蛋白,本研究以这两对异源二聚体为诱饵蛋白筛选与其相互作用的宿主蛋白。首先将PCR扩增的PE25/PPE41或PE35/PPE68基因串联克隆于改造的pc DNA3.1(+)中(... 为筛选与结核分枝杆菌(MTB)的PE25/PPE41和PE35/PPE68两对异源二聚体相互作用的宿主蛋白,本研究以这两对异源二聚体为诱饵蛋白筛选与其相互作用的宿主蛋白。首先将PCR扩增的PE25/PPE41或PE35/PPE68基因串联克隆于改造的pc DNA3.1(+)中(在5'端引入了以编码烟草蚀纹病毒蛋白酶切位点的序列连接的ZZ和Flag标签序列),构建诱饵重组质粒pcDNA-PE25-PPE41和pc DNA-PE35-PPE68。分别将构建的诱饵重组质粒转染293T细胞后提取细胞总蛋白,经ZZ和Flag标签蛋白两步串联亲和层析钓取宿主蛋白,SDS-PAGE电泳分离后切取差异蛋白胶条进行质谱分析,结果显示,PE25/PPE41鉴定到15个差异蛋白,PE35/PPE68鉴定到29个差异蛋白,并分别挑选了与PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的3个和7个差异蛋白,为进一步验证与PE25/PPE41和PE35/PPE68直接作用的宿主蛋白及研究其生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 PE25/PPE41 pe35/PPE68 宿主互作蛋白 串联亲和纯化
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结核分枝杆菌PE35在大肠杆菌中的可溶性表达及产物纯化 被引量:1
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作者 熊志红 朱琰 +2 位作者 孙昌文 庄玉辉 程小星 《临床肺科杂志》 2010年第12期1709-1711,共3页
目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组的结核分枝杆菌PE35蛋白,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv全基因组中获得PE35基因克隆到pET24b中,转化BL21(DE3)构建大肠杆菌表达株;... 目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组的结核分枝杆菌PE35蛋白,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv全基因组中获得PE35基因克隆到pET24b中,转化BL21(DE3)构建大肠杆菌表达株;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组蛋白及其表达方式;使用Ni-sepharose纯化蛋白;Western-blot检测结核病人血清的抗结核抗体。结果酶切鉴定和DNA序列分析显示构建了正确的pET-PE35原核表达载体,并能在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶性地表达分子量大小相符的重组蛋白。纯化后的蛋白纯度达到90%以上,能与结核病人血清抗体结合。结论成功地构建了pET-PE35原核表达载体,并获得较纯的重组PE35蛋白,此蛋白能检测结核病人血清抗体。为探讨PE35蛋白在结核病的基础研究与诊断运用奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 pe35 可溶性表达 纯化
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Evolution of PE35 and PPE68 Gene Families in Mycobacterium: Roles of Horizontal Gene Transfer and Evolutionary Constraints
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作者 Ashay Bavishi Lin Lin +1 位作者 Madhusudan Choudhary Todd P. Primm 《Journal of Tuberculosis Research》 2014年第4期181-198,共18页
Mycobacterium is a genus of bacteria with over a hundred non-pathogenic and pathogenic species, best recognized for certain members known to cause diseases such as tuberculosis and leprosy. Two novel protein families ... Mycobacterium is a genus of bacteria with over a hundred non-pathogenic and pathogenic species, best recognized for certain members known to cause diseases such as tuberculosis and leprosy. Two novel protein families important in the pathogenesis of Mycobacterium species are the PE and PPE families. These two protein families affect the antigenic profiles, disturbing host immunity. To better understand the origin and evolution of these gene families and the differences in their composition between pathogenic and non-pathogenic strains, several bioinformatic analyses were conducted both among Mycobacterium and closely related species that contain PE35 and PPE68 gene homologs. The methods included protein homology searches (BLASTP), horizontal gene transfer analysis (IslandViewer), phylogenetic analysis, gene cluster analysis and structural and functional constraints. Results revealed that PE and PPE gene homologs were not only limited to Mycobacterium, but also existed in three other non-mycobacterial genera, Rhodococcus, Tsukamurella and Segniliparus, and were possibly initially acquired from non-mycobacterial microorganisms by multiple horizontal gene transfers. Results also demonstrated that PE and PPE genes were more diverse and more rapidly evolving in pathogenic Mycobacterium as compared with non-pathogenic Mycobacterium and other non-mycobacterial species. These findings possibly shed light on the diverse functions and origins of the PE/PPE proteins among these organisms. 展开更多
关键词 pe35 PPE68 HORIZONTAL GENE TRANSFER MYCOBACTERIUM
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结核分枝杆菌RD1蛋白PE35干扰宿主细胞的IL-1β通信 被引量:1
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作者 冯婧 喻晓雯 《微生物学免疫学进展》 CAS 2022年第1期15-21,共7页
目的 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)PE35(Rv3872)是PE/PPE家族的成员,在多种压力条件下会下调表达。分析其在宿主天然免疫反应中的作用,为结核病的防治提供新思路。方法 将PE35通过脂质体转染进鼠巨噬细胞RAW264.7中,... 目的 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)PE35(Rv3872)是PE/PPE家族的成员,在多种压力条件下会下调表达。分析其在宿主天然免疫反应中的作用,为结核病的防治提供新思路。方法 将PE35通过脂质体转染进鼠巨噬细胞RAW264.7中,在用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激细胞后,通过RT-PCR和ELISA检测巨噬细胞中细胞因子的表达、Western blot检测巨噬细胞中炎性小体的表达和相关信号通路蛋白的磷酸化状态,探索PE35干扰的信号通路。结果 PE35在RAW264.7细胞中减弱了LPS诱导的白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)的产生和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain like receptors 3, NLRP3)炎性小体的激活(P均<0.05)。PE35降低Akt和IκB-α蛋白的磷酸化(P均<0.05),从而抑制PI3K/Akt和核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)信号通路的活化。结论 PE35通过减弱PI3K/Akt和NF-κB的信号传导来抑制NLRP3激活,从而降低了LPS诱导的巨噬细胞中IL-1β的产生。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 pe35 白细胞介素-1Β 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体 磷脂酰肌醇3-激酶/Akt丝氨酸/苏氨酸激酶 核因子ΚB
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结核分枝杆菌PE35基因真核表达载体的构建及其表达
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作者 熊志红 李仁德 +2 位作者 杨丽萍 朱琰 程小星 《中国预防医学杂志》 CAS 2011年第12期995-997,共3页
目的获得带FLAG标签的结核分枝杆菌PE35的真核表达载体,并在293T细胞中检测其表达。方法用PCR方法从质粒上获得PE35基因全长,克隆到pCDNA3-FLAG真核表达载体上;用脂质体介导的基因瞬时转染法,将构建正确的表达载体转染293T细胞;Western-... 目的获得带FLAG标签的结核分枝杆菌PE35的真核表达载体,并在293T细胞中检测其表达。方法用PCR方法从质粒上获得PE35基因全长,克隆到pCDNA3-FLAG真核表达载体上;用脂质体介导的基因瞬时转染法,将构建正确的表达载体转染293T细胞;Western-blot法检测细胞中的FLAG融合蛋白的表达。结果酶切鉴定和DNA序列分析显示构建了正确的FLAG-PE35真核表达载体,并能在真核细胞中表达相对分子量大小相符的重组蛋白。结论成功构建了FLAG-PE35真核表达载体,并在真核细胞中得到表达。为研究PE35蛋白在结核分枝杆菌中的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 pe35 真核表达
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