hTERT启动子调控PE38KDEL基因载体的构建及其鉴定

目的构建含有hTERT启动子和PE38KDEL基因片段的质粒phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP并对其鉴定。方法通过PCR方法扩增hTERTp,用其取代pIRES2-EGFP质粒的CMV启动子,全基因合成PE38KDEL基因片段,将其亚克隆到hTERTp-IRES2-EGFP的MCS中,经酶切及测序鉴定。结果经鉴定,成功将hTERTp及PE38KDEL两个基因片段插入亚克隆到pIRES2-EGFP中。结论成功构建phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP真核表达载体,有望使PE38KDEL阳性的胰腺癌细胞中特异性表达,起到杀伤胰腺癌细胞的作用,为肿瘤的靶向基因治疗提供了一条新思路。

基因重组毒素HELβ1-PE38KDEL与顺铂杀伤乳腺癌细胞系的协同作用

目的 :研究HELβ1 PE38KDEL与常规化疗药物顺铂杀伤乳腺癌细胞系的协同作用。 方法 :采用细胞增殖、软琼脂集落形成等实验 ,测定HELβ1 PE38KDEL和顺铂对高表达erbB2、3、4的乳腺癌细胞MDA MB 4 5 3,胃癌细胞N87的协同作用 ,并以低表达erbB2、3、4的乳腺癌细胞 2LMP为对照。结果 :HELβ1 PE38KDEL和顺铂联用对MDA MB 4 5 3和N87具有协同杀伤作用 (CI <1)。对 2LMP无协同作用 (CI >1)。结论 :对高表达erbB 2、3、4的乳腺癌细胞 ,基因重组毒素HELβ1 PE38KDEL与顺铂联用具有协同杀伤作用。

IL3-PE38KDEL融合基因的构建及原核表达

目的:构建原核表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL,并诱导和鉴定其蛋白表达。方法:用PCR方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体PQE30-Linker中得到融合基因PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确,转化感受态大肠杆菌SG13009,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析分子量大小,Western blot鉴定。结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL构建成功,IPTG诱导后得到了与预计分子量相符的目的蛋白。经Western blot鉴定在分子量57kD处有明显特异性条带,说明目的蛋白正确表达。结论:成功构建融合蛋白IL3-PE38KDEL,为后续的蛋白质纯化及功能研究奠定基础。

靶向phTERT-PE38KDEL重组质粒联合硼替佐米抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生长的研究

目的:探讨重组质粒phTERT-PE38KDEL联合硼替佐米对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的作用。方法:采用人胰腺癌MiaPaCa2细胞系建立荷瘤裸鼠模型,通过腹腔给药和瘤内注射方式,以硼替佐米联合phTERT-PE38KDEL对荷瘤鼠进行治疗,比较各组肿瘤体积和质量,计算抑瘤率。免疫组化法检测核增殖抗原及微血管密度,TUNEL染色检测肿瘤的凋亡。结果:联合治疗组(A组)的肿瘤体积及瘤重在每个检测点均小于基因治疗组(B组)、单纯化疗组(C组)和空白对照组(D组)(P<0.01),与D组相比,A、B、C组肿瘤抑制率分别为:68.98%、51.44%、16.39%。与B和C组相比较,A组的瘤体PCNA增殖指数与MVD显著降低(P<0.01),A组的细胞凋亡数显著增多(P<0.01)。结论:phTERT-PE38KDEL与硼替佐米对裸鼠胰腺癌移植瘤均有抑制作用,二者联用效果更佳。

hTERT启动子调控下PE38KDEL表达载体的构建及其在MiaPaCa_2人胰腺癌细胞中的表达

目的探讨端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)表达载体的构建及其在MiaPaCa2人胰腺癌细胞中的表达。方法通过PCR法扩增hTERT启动子,全基因合成PE38KDEL,将其分别亚克隆到pIRES2-EGFP及phTERTp-IRES2-EGFP质粒的多克隆位点中;均经酶切及测序鉴定。通过脂质体法将两质粒分别转染MiaPaCa2及WI-38细胞,观察荧光表达情况,通过RT-PCR检测PE38KDEL的表达。结果经酶切及测序鉴定证实质粒构建成功,pPE38KDEL-IRES2-EGFP转染后MiaPaCa2和WI-38细胞中均有PE38KDEL基因表达;但phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP转染后仅MiaPaCa2中有PE38KDEL基因表达。结论 hTERT调控下PE38KDEL表达载体构建成功,并可在MiaPaCa人胰腺癌细胞中靶向性表达,为探讨胰腺癌的靶向基因治疗提供了实验依据。

重组免疫毒素IL3-PE38KDEL真核表达载体的构建

目的:构建大肠杆菌-毕赤酵母表达载体Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。方法:用PCR的方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL,再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体Ppic9k-Linker中,得到融合基因Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确。结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体Ppic9k-IL3-Lin-ker-PE38KDEL构建成功。结论:成功地构建融合基因IL3-PE38KDEL的毕赤酵母表达载体,为后续的蛋白质的表达、纯化及功能研究奠定基础。

靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制备及其体外活性测定

目的:构建基于EGFR纳米抗体的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并检测其对EGFR肿瘤细胞的细胞毒作用。方法:采用分子克隆技术,将靶向EGFR的纳米抗体7D12以二价的形式,通过柔性连接肽(G4S)4与铜绿假单胞菌外毒素的截断形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体p ET28a-BI7D12-PE38KDEL。然后将其转化到BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达。通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,并经Western blot验证。通过流式细胞技术检测该免疫毒素与EGFR阳性细胞A549、HT29、MCF-7和EGFR阴性细胞CEM、Jurkat的结合能力后,将其按照一定的浓度梯度进行细胞毒实验研究,72 h后,使用WST-1试剂检测BI7D12-PE38KDEL对上述细胞的杀伤效果。结果:通过SDS-PAGE和Western blot实验验证,成功的制备了重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该毒素大部分以可溶性的方式表达。BI7D12-PE38KDEL能够与EGFR阳性的A549、HT29、MCF-7肿瘤细胞特异性的结合,并且对上述细胞的细胞毒作用与阴性对照组CEM和Jurkat相比具有极其显著性差异(P<0.01)。结论:成功地构建了基于EGFR纳米抗体的重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该免疫毒素能特异性的结合并杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞。

大鼠IP-10-PE38 KDEL重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达

目的构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PRKL459K-IL-4-PE38KDEL获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建rIP-10与PE38KDEL融合基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL。重组质粒经限制性性内切酶,PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测rIP-10-PE38KDEL融合蛋白在NIH3T3细胞的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,rIP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组基因可在NIH3T3细胞表达。结论rIP-10-PE38KDEL融合基因可在NIH3T3细胞中表达,为进一步研究其对自身免疫病的Th1细胞靶向毒性及临床应用奠定基础。

铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、PCR扩增鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后及蛋白免疫印迹法分别测定其大小和特异性。结果经鉴定证实原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了PE38KDEL与GST的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被PE的特异性抗体所识别。结论PE38KDEL在大肠杆菌中获得了高效的融合表达,为下一步研究其功能奠定了基础。

抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测

目的:构建基于抗B7-H4单链抗体(sc Fv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达,蛋白经变复性和镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化后进行Western blot鉴定;间接ELISA和流式分析技术进行特异性鉴定。利用MTT法和皮下移植瘤模型实验,检测毒素对体外、内肿瘤细胞的抑制作用,并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。结果:酶联后得到重组表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,纯化后的毒素蛋白对肿瘤细胞具有一定杀伤力,并且在肿瘤模型实验中能抑制体内肿瘤的生长。结论:成功构建了基于抗B7-H4单链抗体的重组毒素表达体系,经鉴定重组毒素蛋白有良好的生物学功能活性和抗肿瘤活性。

绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的:通过原核表达系统制备绿脓杆菌外毒素(PE)PE38KDEL重组蛋白,并制备特异性兔免疫血清多克隆抗体。方法:选择PE部分基因(PE38),并将C端609-613位的氨基酸REDLK突变为KDEL,通过原核密码子优化(http://www.jcat.de)后全基因合成,经Hind III和Xho I酶切位点克隆至p ET32a(+)原核表达载体,构建p ET32a(+)/PE38KDEL重组质粒,将测序正确的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细菌中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组PE38KDEL蛋白,经Ni-NTA亲和层析法制备纯化蛋白,采用SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。进一步将PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔制备PE38KDEL特异性多克隆抗体,并采集免疫前后血清,用ELISA法检测免疫后的抗体反应和效价。结果:成功构建了p ET32a(+)/PE38KDEL重组质粒。在原核表达系统中该质粒成功表达并获得纯化的PE38KDEL蛋白。SDSPAGE电泳显示蛋白分子质量约为57 k Da,与预计理论值大小相符合。Western blot法检测结果显示,在分子质量约57 k Da处出现单一条带。通过免疫大耳白兔成功获得PE38KDEL特异性多克隆抗体,抗体效价高达1:60 000。结论:PE38KDEL蛋白可诱导兔产生特异性多克隆血清抗体,且该抗体效价高、特异性强,为进一步研究基于PE38KDEL毒素的生物学和免疫学等功能奠定了基础。

一种适用于家蚕核型多角体病毒的PCR检测方法

建立家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的快速检测技术,有利于病害的早期诊断。选择家蚕核型多角体病毒极早期基因pe38为靶基因设计特异性检测引物,对不同浓度BmNPV基因组DNA模板及含有pe38的重组质粒pMD18-pe38标准品进行PCR检测,结果扩增出BmNPV 370 bp的特异性片段,病毒多角体的最低检测浓度为4.86×103mL-1,标准质粒的最低检测量为0.7 pg。将BmNPV感染家蚕幼虫后不同时间取其血淋巴用于PCR检测方法的验证,结果表明,接种病毒多角体浓度为4.86×108mL-1时,感染36 h后取样的幼虫血淋巴中能扩增出370 bp的病毒特异条带,可检出病毒的时间随添毒浓度的递减而延迟。该检测方法具有较好的特异性和灵敏度。

假单胞菌外毒素体外靶向抗肝细胞癌的实验研究

目的:构建携铜绿假单胞菌外毒素PE38基因及甲胎蛋白(AFP)启动子的重组载体,并研究其在体外对AFP阳性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的靶向杀伤作用。方法:构建重组免疫毒素表达质粒pAFP-PE38,通过转染细胞观察其作用,RT-PCR法测定PE38 mRNA表达,CCK-8法检测细胞毒性。结果:各组细胞转染质粒pAFP-PE38后仅AFP阳性的HepG2细胞表达PE38 mRNA,且形态发生改变,生长显著受抑(P<0.01),48 h和72 h抑制率分别为27.2%、58.3%,而AFP阴性的PC-3和HeLa细胞未受明显影响。结论:PE38基因真核表达载体可实现HCC基因治疗的靶向性和高效性,有望成为肝细胞癌靶向基因治疗的有力工具。

基于PCR方法的美国白蛾核型多角体病毒早期检测

根据美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus,HcNPV)pe38基因设计两对引物,利用PCR法检测HcNPV基因组DNA,分别扩增出长为994和614bp的片段,经测序确定为HcNPV pe38基因片段。应用两对引物分别检测了美国白蛾病虫的总DNA和获得的病毒多角体,其检测最低量分别为1fg病虫总DNA和3～4OBs/mL。用不同浓度的病毒感染试虫后,不同时间取其血淋巴用PCR方法检测。结果表明,接毒量为3.53×109OBs/mL时,24h后可检出病毒DNA;接毒量为3～4OBs/mL时,120h后可检出。病毒可检出时间随接毒浓度的递减而延后。

抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素的构建 表达及生物学活性鉴定

目的构建抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核融合表达载体,并对其表达产物进行生物学活性鉴定。方法应用PCR方法体外扩增NP11-4VH、VL、scFv和PE38KDEL基因,经测序后将scFv及PE38KDEL基因通过限制性内切酶双酶切及连接反应,构建原核表达载体pBAD/gIIIA-scFv-PE38KDEL,转化E.coliTop10F′,L-阿拉伯糖诱导表达,表达产物经Western blot及ELISA鉴定其活性。结果构建了重组免疫毒素表达载体pBAD/gIIIA-scFv-PE38KDEL,诱导表达产物主要以包涵体形式存在,分子量约为70kD;经变性、复性后的重组免疫毒素与血吸虫可溶性虫卵抗原有较好的结合活性。结论构建及表达了抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素,为血吸虫病治疗提供了一条新思路。