PEDV乳酸菌工程菌株对小鼠的免疫效果研究

本研究以引起猪流行性腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为研究目标,利用含有PEDV S基因的植物乳杆菌活载体菌株LP1522-PEDS口服免疫小鼠,应用ELISA试验检测免疫小鼠粪便中SIgA含量、血清中IgG、IL-4、IL-2和IFN-γ含量,评价乳酸菌重组菌株LP1522-PEDS对小鼠的免疫效果。结果表明,首次免疫后,商品灭活疫苗组和工程菌株免疫组粪便中的SIgA、血清中的IgG、IL-4、IL-2和IFN-γ含量较对照组显著升高(P<0.05)。在免疫42~56 d,灭活疫苗组和重组菌株组抗体水平均达到最大值,抗体和免疫因子水平依次为:商品灭活疫苗组>LP1522-PEDS组>空载组≈对照组。随后商品灭活疫苗组、LP1522-PEDS组抗体和免疫因子水平逐渐下降。免疫70 d,商品灭活疫苗组抗体水平降幅度相对较小,工程菌株免疫组降幅较大。结果表明,小鼠口服携带PEDV S基因的基因工程植物乳杆菌LP1522-PEDS后能够诱导机体产生PEDV免疫应答。

单月桂酸甘油酯对PEDV感染3D4/21巨噬细胞基因表达的影响

试验旨在研究单月桂酸甘油酯(ML)对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染3D4/21巨噬细胞基因表达的影响。通过ML对3D4/21细胞活力试验和PEDV在3D4/21细胞中的生长曲线确定最适浓度和最佳时间后,将3D4/21细胞随机分为3组(control组、PEDV组、PEDV+ML组),各组分别以全时添加10µmol/L ML和PEDV感染细胞后添加10µmol/L ML两种方式进行处理,并检测相关基因相对表达量。结果表明:添加10µmol/L的ML对3D4/21细胞生长具有显著的促进作用(P<0.05),病毒感染3D4/21细胞的48 h内PEDV-S、M、N基因相对表达量呈现先增加再降低的趋势,12 h时处于最高;与PEDV组相比,PEDV+ML组全时添加ML处理12 h使PEDV-S、M、N、IL-8、IFN-β、IFITM3基因相对表达量显著下调(P<0.05),处理24 h使PEDV-S、M、N、IL-8、IFN-β、MX1、ISG15、IFIT1和IFITM1基因相对表达量显著下调(P<0.05),KCNJ13基因相对表达量显著上调(P<0.05)。与PEDV组相比,PEDV+ML组在感染后添加ML处理12 h使MMP13基因相对表达量显著下调(P<0.05),PEDV-M基因相对表达量显著上调(P<0.05),处理24 h使IL-6、IL-8、IFN-β、MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1、IFITM3基因相对表达量显著下调(P<0.05),PEDV-S、M、N、KCNJ13基因相对表达量显著上调(P<0.05)。综上所述,PEDV感染前ML预处理具有一定的抗病毒效果;PEDV感染使细胞处于免疫应激状态,ML有一定的缓解作用。

基于网络药理学和分子对接探究白杨素和柚皮素抗PEDV的作用机制及试验验证

【目的】探讨白杨素和柚皮素抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的作用靶点和机制,为进一步以白杨素和柚皮素开发新型抗PEDV的治疗药物提供理论依据。【方法】利用PharmMapper、TCMSP、SEA Search Server和STITCH在线数据库获得白杨素和柚皮素的潜在作用靶点,同时检索GeneCards数据库获得PEDV对宿主的作用靶点,利用在线程序Draw Venny Diagram获取白杨素、柚皮素与疾病的交集靶点。通过STRING数据库和Cytoscape 3.9.1软件构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选关键靶点,对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。通过AutoDock Vina v 1.2.0软件对核心靶点及小分子进行分子对接,并分析白杨素和柚皮素与靶蛋白的结合能和结合模式,利用PyMOL v 2.5实现对接结果的可视化。采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测白杨素和柚皮素对核心靶蛋白表达的影响。【结果】白杨素潜在抗PEDV的靶点有12个,其中白蛋白(ALB)、雌激素受体1(ESR1)、转化生长因子β-1蛋白(TGF-β1)可能是白杨素抗PEDV的核心靶点;柚皮素潜在抗PEDV的靶点有18个,其中ALB、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)可能是柚皮素抗PEDV的核心靶点。白杨素抗PEDV靶点涉及21种生物过程、5种细胞组分和6种分子功能,共获得11条信号通路;柚皮素抗PEDV靶点涉及31种生物过程、8种细胞组分和19种分子功能,共获得13条信号通路。核心靶点与两种天然化合物之间以氢键和疏水作用力为主,有较强的相互作用。白杨素和柚皮素能极显著降低Caspase-3表达量(P<0.01),可能通过影响Caspase-3的表达和活化来颉颃PEDV诱导的细胞凋亡;极显著升高TGF-β1蛋白表达量(P<0.01),可能通过影响TGF-β1的表达抗PEDV诱导的炎症反应而治疗PEDV的感染。【结论】本研究揭示了白杨素和柚皮素分别通过潜在核心靶点ALB、ESR1、TGF-β1和ALB、Caspase-3、PPARG,以及IL17、PI3K-Akt和AMPK信号通路发挥抗PEDV作用的机制,为新型抗PEDV药物的研发提供新的思路。

猪肉及制品中HEV、PEDV和PDCoV三重qPCR方法的建立与应用

人兽共患病引发的动物源性食品安全事件频发,为从食品原料源头上控制和保障其食用安全,控制猪肉及其制品消费成本,本研究构建了可同时检测猪肉及制品中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(Porcine delta corona virus,PDCoV)三重实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)方法。结果表明,三重qPCR方法只能扩增出3种目的病毒的特异性基因片段,特异性好;对HEV、PEDV和PDCoV三种病毒的最低检测限分别为6.02、6.98、6.92 copies/μL;组内和组间变异系数(CV%)在0.10%~3.00%之间,重复性好。将所建立方法应用于248份出口猪肉及制品和282份生猪粪拭子的检测,同时以相应病毒标准检测方法进行平行检测,结果显示猪肉及制品中三种病毒的检出率均为0%,与标准方法检测结果一致。生猪粪拭子中,该方法对PEDV、PDCoV和HEV三种病毒的检出率分别为1.06%、3.19%、0.35%,标准方法检出率分别为1.06%、3.19%、0%。研究表明,建立的三重qPCR检测方法能准确快速地检测猪肉及制品或生猪样品中三种病毒,为保障生鲜猪肉及其制品市场流通和阻断病毒食源性传播提供技术支持。

PEDV、TGEV与PDCoV S蛋白表位基因三联疫苗的构建及其鉴定

[目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。[结果]构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。[结论]本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。

贵州省2017年~2023年PEDV和PoRVA流行病学调查及PoRVA VP7、VP4基因的遗传演化分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪A群轮状病毒(PoRVA)的流行情况,本研究对2017年~2023年来自贵州省9个地区139个猪场的165份仔猪粪便样品进行Taq Man RT-qPCR检测,并对PoRVA阳性样品VP7、VP4基因进行RT-PCR扩增、测序,遗传进化分析及其编码氨基酸序列的变异分析。结果显示,PEDV、PoRVA和PEDV+PoRVA的感染率分别为67.88%(112/165)、38.79%(64/165)和21.21%(35/165),且在不同年份、不同地区和不同季节均检出三者的感染。PCR结果显示,本实验扩增出27株PoRVA VP7基因和22株VP4基因;遗传进化分析结果显示共鉴定出6种G型和3种P型,其中G9(29.63%)和P[13](68.18%)为优势基因型,G3、G4、G5、G11、G26、P[6]和P[23]分别占7.41%、22.22%、22.22%、3.70%、14.81%、13.64%、18.18%。21份PoRVA样品鉴定出10种G/P组合基因型,G9P[13](19.05%)为优势组合基因型,G4P[13]、G5P[13]、G3P[13]、G4P[6]、G5P[23]、G9P[23]、G11P[13]、G26P[6]、G26P[13]分别占14.29%、14.29%、9.52%、9.52%、9.52%、9.52%、4.76%、4.76%及4.76%。同源性分析结果显示,27株VP7基因和22株VP4基因序列与NX疫苗株相应基因序列之间的同源性分别为75.5%~94.0%和68.5%~75.6%,氨基酸序列的同源性分别为78.3%~96.6%和72.0%~82.5%,部分PoRVA上述基因序列与国外、人源RVA的同源性最高。氨基酸位点变异分析结果显示,与NX疫苗株相比,所测PoRVA VP7和VP4氨基酸序列均存在特征性位点的变异,其中G型PoRVA VP7无氨基酸位点的缺失和插入,G9型PoRVA VP7存在3处(I^(208)T、K^(212)A/V/T、V^(271)I)变异,G3、G4、G5、G11和G26型PoRVA VP7存在17处(S^(28)R/K、A^(29)I/T/M/V、L^(40)I/V、V^(44)L、S^(71)T、Q^(73)G/N/S/E、S^(90)A/Q/K/R、G^(94)N/S/A/K、N^(100)D/E、T^(122)A/S、T^(147)A/G/N/D、Q^(189)S/T、I^(208)L/Q/T、K^(212)T/I/P/N、A^(213)N/T/D、E^(267)D/N、V^(271)I)变异;3株P[6]型PoRVA VP4在aa136缺失T,13株P[13]型PoRVA VP4在aa188~aa189插入E/D~Y/F,P[6]、P[13]和P[23]型PoRVA VP4存在26处(I^(92)V、Q^(94)E、Q^(113)T/P/N、T^(114)N/Q/S/R、T^(115)Q/E、N^(116)S/L/T、P^(148)A/Q/V/S/I、T^(180)E/N/D、P^(162)T、I^(174)V/L、C^(269)Y、R^(281)N、A^(286)L/S、T^(302)N、A^(340)S/V、T^(379)S、T^(403)A、S^(438)P、R^(553)K、A^(569)A、M^(570)L、A^(608)S、E^(660)D、I^(726)F、K^(733)N、S^(739)T)变异。上述结果表明,2017年~2023年贵州省PEDV和PoRVA感染率高且基因型复杂,其中PoRVA存在以G9型、P[13]型为主的流行,优势组合基因型为G9P[13]。本研究丰富了贵州省PEDV和PoRVA的流行病学资料,尤其为PoRVA感染的防控和候选疫苗株的筛选提供了参考数据。

PEDV结构蛋白颉颃IFN-Ⅰ应答的分子机制研究进展

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)具有很高的发病率和死亡率,尤其是在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)高致病性变异株(GⅡ型毒株)出现以来,更是对全球养猪业构成了巨大威胁。病毒感染宿主之后,宿主会激活抗病毒天然免疫应答机制。干扰素(interferon,IFN)作为一类抵御病毒感染的关键分子,特别是Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)可通过激活各种免疫细胞和共刺激分子来颉颃病毒的增殖。与此同时,为实现在宿主内的持续复制,许多病毒建立了颉颃宿主机体IFN-Ⅰ应答的多种分子机制,进而实现免疫逃逸。PEDV编码的多种结构蛋白可以颉颃宿主IFN-Ⅰ免疫应答。文章综述了PEDV结构蛋白颉颃IFN-Ⅰ免疫应答的分子机制,以期为深入阐释PEDV免疫逃逸的分子机制与开发PEDV新型靶向药物和建立防控新策略提供科学参考。

金银花源miR2911靶向PEDV基因区域分析

金银花源miR2911是一种丰度较高、性质稳定的抗病毒分子,在抗流感病毒感染和SARS-CoV-2感染中发挥着关键作用。然而,有关miR2911靶向PEDV基因区域的研究却鲜有报道。因此,本研究旨在分析miR2911靶向PEDV的基因区域,进一步分析miR2911靶点在不同流行毒株中的保守性。利用miRanda软件成功预测miR2911在PEDV基因组中存在多个靶点,靶向PEDV基因区域保守性很高。为后续深入研究miR2911在抗猪源病毒感染的机理提供了数据支撑。

丁壮素酸乳对PEDV和PRRSV体外增殖的影响

为探究丁壮素酸乳对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)体外增殖影响,本研究使用CCK-8法分别检测丁壮素酸乳对Vero细胞和Marc-145细胞的毒性,采用实时荧光定量PCR分别检测PEDV、PRRSV在不同质量浓度丁壮素酸乳作用下的基因组拷贝数。实验结果显示:100~500μg/mL丁壮素酸乳对Vero细胞和Marc-145细胞活性没有显著影响;200~300μg/mL丁壮素酸乳显著抑制PEDV增殖,100~300μg/mL丁壮素酸乳显著抑制PRRSV增殖。实验结果表明,200~300μg/mL丁壮素酸乳对PEDV和PRRSV的体外增殖具有显著的抑制作用,且无细胞毒性。

不同全自动核酸提取仪对ASFV、PEDV提取效果的比较

【目的】以倍比稀释的ASFV(非洲猪瘟病毒)阳性对照样品以及PEDV(猪流行性腹泻病毒)阳性对照样品为检测对象,对比3款全自动核酸提取仪对DNA和RNA的提取效果,旨在帮助猪场配备的实验室筛选合适、可靠的全自动核酸提取仪。【方法】倍比稀释好的ASFV、PEDV阳性对照样品,每个梯度设置3个平行重复,诺维赞核酸提取仪(VNP-32P)为处理1,西安天隆核酸提取仪(NP968-C)为处理2,博日核酸提取仪(NPA-32P)为处理3,根据3款全自动核酸提取仪及提取试剂盒的说明书将对应阳性样品进行核酸提取,再根据英迪康的virotype?非洲猪瘟病毒2.0 PCR检测试剂盒以及世纪元亨的流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的说明书进行体系配制、上样、程序设置,进行核酸扩增。【结果】同一浓度梯度的ASFV、PEDV阳性对照样品,处理3所提核酸的扩增结果 CT值较处理1和处理2的低,而处理1和处理2提取效果不相上下。【结论】3款核酸提取仪的稳定性都满足需求;博日核酸提取仪(NPA-32P)的提取效果优于另外2款,诺维赞核酸提取仪(VNP-32P)和西安天隆核酸提取仪(NP968-C)的提取效果接近。

PEDV、TGEV、PoRV 3种猪病毒性腹泻病毒的流行现状及控制策略

引起猪病毒性腹泻的病原主要有猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)及猪轮状病毒(porcine rotarvirus,PoRV),临床均以呕吐、严重腹泻和脱水为特征,哺乳仔猪发病率和病死率较高,后备猪、母猪或育肥猪呈一过性腹泻,发病率较低。特别是自2010年以来,PEDV变异毒株的流行已对全球的生猪产业造成严重影响,而已有的防控措施已经不能应对新的流行态势。近年来,针对PEDV、TGEV、PoRV的毒株流行变化及防控措施研究的较多,许多新技术、新方法已应用于3种病原的控制。作者基于当前3种病毒的遗传变异分析和流行现状,从饲养管理、免疫预防、中药疗法、干扰疗法、特异疗法及返饲疗法等方面对防控措施进行综述,以期为猪病毒性腹泻的防控提供科学依据。

PEDV、TGEV、PARV多重RT-PCR检测方法的建立及其应用

建立了一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)的三重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验。在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(PEDV)、544 bp(TGEV)、275 bp(PARV)特异性片段,而其他病毒无特异性条带。应用该方法对江苏省及周边地区154份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测,结果表明:PEDV、TGEV、PARV阳性率分别为53.2%、8.4%、5.2%。PEDV与TGEV混合感染率为5.2%,PEDV与PARV混合感染率为4.5%。该方法的建立对临床上进行这3种疾病混合感染的检测具有重要意义。

PEDV S蛋白B细胞抗原表位的筛选和鉴定

以猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S基因的免疫优势区S1(1～2367bp)为靶基因,利用基于gⅢ表达外源多肽的fd丝状噬菌体展示系统,构建S1基因噬菌体展示肽库,以纯化病毒制备的兔抗PEDV多克隆血清为靶蛋白,对S1基因噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选,结果获得3个高亲和力的序列,分别命名为S1P1(248～280位氨基酸)、S1P2(442～499位氨基酸)和S1P3(697～742位氨基酸).ELISA和蛋白质印迹结果显示,S1P1、S1P2和S1P3短肽都能被兔抗PEDV多克隆血清识别,其中S1P3反应性最强.为了进一步揭示S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性,制备了3个短肽GST融合蛋白和它们串连后GST融合蛋白的单因子血清,间接免疫荧光试验(IFA)结果证实,抗S1P2-GST、S1P3-GST和S1P123-GST融合蛋白的单因子血清能够识别Vero细胞培养物中天然的PEDV.

猪流行性腹泻病毒(PEDV)与抗病毒天然免疫

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起猪流行性腹泻病等肠道疾病的一种动物冠状病毒.PEDV与宿主系统相互作用,特别是其对宿主抗病毒天然免疫调节作用和机制是目前动物冠状病毒研究的基础科学问题之一.基于作者近几年来对人类重要冠状病毒对宿主抗病毒天然免疫系统调节作用的研究,本文对PEDV基因组与编码蛋白主要功能以及PEDV调节宿主抗病毒天然免疫反应及其可能机制的进展和现状进行了分析.与人类冠状病毒相似,PEDV编码的木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLP)是一个多功能蛋白酶,除了蛋白酶活性外,还具有去泛素化酶(DUB)活性和宿主干扰素拮抗活性,是PEDV编码的一种新型病毒来源DUB和宿主干扰素拮抗蛋白.这些研究为阐明PEDV对宿主抗病毒天然免疫反应调节作用和其致病机制提供了重要的理论依据,为研制新型PEDV免疫防治措施提供了重要理论基础.

一例猪PEDV和PDCoV双重感染的诊断

为了查明贵阳市某猪场仔猪严重腹泻、呕吐、脱水、食欲下降致仔猪死亡的原因,试验采用临床症状观察、病理剖检、细菌的分离培养及PCR/RT-PCR等检测。结果表明：送检病死仔猪为流行性腹泻病毒（PEDV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）双重感染。说明该猪场猪发病是由PEDV和PDCoV双重感染所致,应采取相应的治疗及预防措施,防止该病的扩散。

PEDV亚单位疫苗免疫增强剂的筛选

为了研究PEDV的新型亚单位疫苗,提高PEDV亚单位疫苗的免疫原性,选取免疫增强剂CVC1302、CVC1303与国家兽用生物制品工程技术研究中心构建的可溶性表达PEDV S蛋白核心表位COE的重组蛋白(p QZCOE-LTB)混合乳化制成疫苗,免疫4周龄的ICR小鼠,首免14 d后加免1次,随后采集首免14(加强免疫前),21,28,55 d的小鼠血清,分别用琼扩试验的方法定性检测血清IgG抗体以及用ELISA试剂盒定量检测小鼠血清IgG抗体滴度动态变化,肠组织sIgA抗体滴度。结果表明,重组蛋白与CVC1303配合使用免疫小鼠能产生显著高于灭活苗(CV777)阳性对照组的IgG和sIgA抗体水平,说明CVC1303免疫增强剂能有效增强该重组蛋白的免疫原性,提高亚单位疫苗免疫效果。

PEDV地方流行毒株S1基因的遗传变异分析及HLJ-2012株免疫原性检测

为探讨猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）再次爆发原因，对现阶段黑龙江省和内蒙古自治区的10株猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）流行毒株S1基因进行扩增、克隆和序列测定，通过序列比对分析其遗传演化特点。选择其中一株毒株进行中和试验，对其免疫原性做初步分析。结果表明，10株PEDV的S1基因与参考毒株相比，核苷酸同源性为86.8%-99.7%；且S1基因均存在点突变、碱基插入及缺失的情况；构建的系统发育树表明PEDV毒株在S1基因水平上共分为两个群，本试验中的10株均处在G1群，与2011-2012年3株其他地区毒株CH/SDQD/2011、CH/HBQHD/2011和HuN亲缘关系较近，而与G2群中的经典毒株CV777及我国以往报道过的LJB/03等亲缘关系较远；通过中和试验，判断出新发毒株HLJ-2012对传统毒株LJB/03具有一定的中和效应，中和效价为1？？53.83。

猪流行性腹泻病毒PEDV-GD12株的分离与鉴定

采集广东省某猪场腹泻仔猪的小肠病料,通过在Vero细胞上培养,RT-PCR及间接免疫荧光检测,电镜观察等方法鉴定,确定分离到一株PEDV毒株,并命名为PEDV-GD12。通过对PEDV M基因的克隆测序以及进化分析,显示所分离到的毒株近年来流行的毒株同源性很高,处在同一分支上。

PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。

PEDV ps420片段乳酸乳球菌表达及免疫中和活性检测

将猪流行性腹泻病毒LJB/03株S基因上编码中ps420(1 495～1 916 bp)基因片段插入乳酸乳球菌pNZ8112中,构建了重组表达载体pNZ8112-ps420,将其电转化入乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000,获得了表达猪流行性腹泻病毒S基因ps420的重组乳酸乳球菌,经乳链菌肽(Nisin)在GM17培养基中诱导表达,SDS-PAGE检测表明,约有大小分别为15 ku的蛋白得到表达,与理论值相符。Westernblot结果和间接免疫荧光试验结果分析表明,表达的蛋白在菌体表面且可被兔源PEDV抗血清所识别。重组菌口服免疫接种家兔获得抗血清,进行PEDV细胞中和试验结果表明重组菌可诱发血清中和IgG产生,血清中和抗体效价达1∶105。