PEDV M蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路的抑制作用

【目的】研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。【方法】克隆PEDV M基因,构建其真核表达载体pcDNA3.1-Myc-PEDV-M,并转染HEK-293T细胞。采用Western bloting试验检测M蛋白的表达。通过双荧光素酶报告试验检测M蛋白对SeV诱导的干扰素通路活化的影响;通过Real-time PCR分析M蛋白对SeV诱导的IFN-β及干扰素刺激基因ISG54、ISG56、RIG-I mRNA表达的影响。通过过表达试验验证上调表达M蛋白对PEDV复制的影响。【结果】克隆了676 bp的PEDV M基因,成功构建其真核表达载体pcDNA3.1-Myc-PEDV-M,且其可在HEK-293T细胞中表达。PEDV M蛋白可抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活,且M蛋白对SeV诱导的Ⅰ型干扰素通路活化的抑制具有剂量依赖效应;M蛋白能够抑制IFN-β与干扰素诱导基因ISG52、ISG56、RIG-I mRNA的表达,并具有剂量依赖效应。过表达试验表明,M蛋白在抑制Ⅰ型干扰素信号通路激活的同时促进PEDV复制。【结论】PEDVM蛋白能够抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活,并促进PEDV复制。

变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定

【目的】体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。【方法】将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白。通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性。【结果】扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%。将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%。以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体。【结论】通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。

猪流行性腹泻病毒的分离及其M基因的生物信息学分析

为了解贵州猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的变异情况,对分离PEDV的M基因进行了克隆测序和生物信息学分析。结果表明:分离的PEDV株(用N-GZ表示)与贵州省动物疫病研究室曾报道的PEDV株(用GZ表示)位于同一进化分支,与疫苗株CV777处于不同进化分支。N-GZ株与GZ株M基因的核苷酸序列相似性为98.5%,表明其亲缘关系较近,与CV777疫苗株的亲缘关系稍远。多重比较发现,N-GZ株与CV777株M蛋白的抗原表位区存在3个氨基酸的差异,与GZ株相比存在2个氨基酸的突变。M基因是PEDV的保守基因,但N-GZ株M基因在抗原表位区存在一定程度突变。

猪流行性腹泻病毒M蛋白对Ⅰ型干扰素产生的影响

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白M对Ⅰ型干扰素(IFN)产生及其信号通路的影响,将PEDV M蛋白表达质粒转染HeLa细胞后用poly(I:C)刺激,应用双荧光素酶分析系统对IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN-β、IFN刺激基因15(ISG15)、ISG56转录水平进行检测,应用Western-blot对IRF3磷酸化及CREB结合蛋白(CBP)表达进行检测,应用IFA试验对IRF3核移位及CBP蛋白表达进行检测。结果显示,M蛋白过表达细胞内IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平显著下调,IFN-β、ISG15、ISG56转录水平显著下降,TRAF3、TBK1、IKKε、IRF3蛋白过表达细胞内的IFN-β-Luc表达水平显著降低,但IRF3的磷酸化、核移位以及CBP的表达不受影响。结果表明,PEDVM蛋白可以通过对IRF3信号通路的影响来抑制Ⅰ型IFN的产生。

猪流行性腹泻病毒M和S蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白和S蛋白基因的亲水区进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆至原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma和pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。表达产物经SDS-PAGE后切胶免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价,Westernblot和间接免疫荧光方法检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达,且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLP)抗原和建立血清学检测方法奠定基础。