交联型聚乙烯亚胺智能基因载体的制备及PEG化影响

使用胱胺双丙烯酰胺(CBA)对低分子量聚乙烯亚胺(PEI)进行交联反应制备智能降解型聚阳离子基因载体.通过与聚乙二醇(PEG)反应得到不同程度PEG化的聚阳离子载体.利用核磁、黏度测试、粒度仪、zeta电位仪和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与DNA的复合物进行了表征.研究表明随着PEG含量的增加,聚阳离子载体/DNA复合物颗粒粒径变小、表面正电荷降低,PEG具有明显的屏蔽作用,但过多的PEG也使载体与DNA复合能力下降.通过MTT细胞毒性测试和荧光素酶质粒转染实验得出,含二硫键的交联型阳离子聚合物在测试范围内显示了非常低的细胞毒性,最佳转染效率是PEI25k的4倍,PEG化后其细胞毒性得到进一步改善,转染效率却明显降低.

PEG化壳聚糖/DNA自组装复合物的制备、表征和体外Hela细胞转染研究

通过有机合成和高分子聚合等方法将亲水性的聚乙二醇接枝到壳聚糖的氨基侧链上 ,得到了改性的壳聚糖 -聚乙二醇接枝共聚物 ,应用现代波谱等技术对中间产物和最终产物进行了表征 .采用绿色荧光蛋白基因质粒 p EGFP-N1为 DNA模型 ,在溶液中通过自动 (静电 )吸附得到 PEG化的壳聚糖 /DNA自组装复合物 .初步研究了该自组装复合物对 Hela细胞的体外转染效率 .结果表明 ,活化的聚乙二醇被成功地接枝到壳聚糖上 ,使不溶于水的壳聚糖改性为水溶性的 PEG化的壳聚糖 . PEG化壳聚糖 /DNA自组装复合物在Hela细胞体外转染率达到 81 % .因此 ,PEG化的壳聚糖有可能成为基因转染的非病毒载体 .

PEG化脂质体多柔比星在动物体内的药动学及组织分布

比较研究了PEG化脂质体多柔比星(阿霉素)受试制剂与进口同类参比制剂静注后,在动物体内的药动学及组织分布。采用HPLC法测定Beagle犬的血药浓度和荷瘤(Walker256)Wistar大鼠各组织药物浓度。结果显示,Beagle犬静注1mg/kg受试制剂及参比制剂后,药动学参数分别为t1/2β23.0和23.5h,表观分布容积0.060和0.062L/kg,AUC0-∞500.29和531.57μg·ml-1·h,多柔比星在犬体内的药代动力学过程均符合二室模型的特征。荷瘤(Walker256)Wistar大鼠静注5mg/kg受试制剂及参比制剂后,脾中含量最高,其次为肿瘤、小肠、肝,皮肤中含量最低。统计学分析显示,两制剂在犬体内主要药动学参数及大鼠组织肝、心、脾、肾、小肠、皮肤和肿瘤内的分布,无显著性差异(P>0.05)。

氨基PEG化试剂的合成及其修饰能力的测定

分别用氰脲酰氯法及Ｎ－羟基丁二酰亚胺活性酯法合成了蛋白质的氨基ＰＥＧ化试剂ｍＰＥＧｃｃ和ｍＰＥＧ－ＧＳ，并研究了它们对蛋白质的修饰作用。在合成过程中，通过分析反应体系中微量水分的存在对ｍＰＥＧｃｃ合成效率的影响，及溶剂中小分子可活化杂质成分对ｍＰＥＧ－ＧＳ合成产物质量的影响，发现去水剂的存在，可使ｍＰＥＧｃｅ产率提高７倍；二氧六环优于ＤＭＦ，且二氧六环的预处理也很重要。同时，为了测定活化ＰＥＧ修饰蛋白质的效能，首次以ＢＳＡ为模型蛋白，建立起一种测定活化ＰＥＧ修饰能力的方法，应用此方法能直观而又准确地比较各种方法活化的ＰＥＧ对蛋白质的修饰能力，具有普遍的意义。

RP-HPLC法检测CN_(10)蛋白的PEG化修饰率及含量

目的建立一种简单有效的测定CN10蛋白PEG化修饰率的方法 ,用于PEG化修饰工艺中的质量控制。方法采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,以TSKgel Octadecyl-4PW作为色谱分离柱,以含0.12%三氟乙酸(TFA)、5%乙腈的水溶液作为A相溶液,以含0.1%TFA的乙腈作为B相溶液,在50℃柱温条件采用分段线性洗脱的方式分离蛋白,并考察CN10蛋白以及PEG化修饰后CN10蛋白的量效关系,根据外标法检测CN10和CN10-PEG的蛋白含量,根据PEG化修饰前后CN10蛋白量效关系的变化推断CN10蛋白的PEG化修饰率。结果 PEG化修饰前后的CN10蛋白经TSKgel Octadecyl-4PW色谱柱层析均能达基线分离,当用214 nm波长检测时,CN10蛋白浓度以及PEG修饰后的CN10蛋白均与其对应峰面积呈现良好的线性关系(r2=0.999 58;r2=0.999 67)。结论建立了一种简单快速的检测CN10蛋白PEG化修饰率的方法 ,此方法具有较高的准确性及专属性,可用于CN10的PEG化修饰工艺的监测。

白细胞介素－2的PEG化

用自制的氨基ＰＥＧ化试剂ｒＩＬ－２进行化学修饰，研究了试剂浓度，溶液ｐＨ，反应时间等与ＰＥｃａ－ｒＩＬ－２产率及ＩＬ－２活性保持之间的关系，建立了一套获得稳定修饰度的ＰＥＧ－ｒＩＬ－２的方法。研究发现，反应时间跟修饰度关系不大；溶液ｐＨ对修饰度有一定的影响，中性ｐＨ以上反应都可进行；而试剂浓度直接决定修饰度的高低，过量越多，修饰度越高，而生物活性保留也越低；但低度修饰，对活性几乎没有影响，可保留活性在９５％左右。

高分子超/微滤膜的亲水化改性：从PEG化到离子化

众多高分子超/微滤(UF/MF)膜材料存在疏水性强、抗污染能力低下、生物相容性不佳的缺点,限制了UF/MF膜的推广应用,膜材料的亲水化改性被认为是解决这一难题的有效方法,也是近年来膜材料领域的研究热点之一。高分子UF/MF膜的亲水化改性方法可分为物理改性和化学改性两大类,在这些方法中,膜表面的聚乙二醇(PEG)化和离子化占据了重要地位,近年来,UF/MF膜的亲水化改性研究重点呈现出从PEG化向离子化转移的趋势。首先对UF/MF膜材料的各种改性方法进行了简要的综述,然后重点阐述了UF/MF膜亲水化改性中的PEG化和离子化研究进展。

重组人粒细胞集落刺激因子的N端氨基定点PEG化修饰(英文)

尽管重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有重大的治疗价值,然而在实际应用却受到体内半衰期过短因而需要频繁重复注射的限制.为了解决这一问题,我们利用两种不同分子量(5 kD和20 kD)的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-PAL)对rhG-CSF的N端氨基进行了定点PEG化修饰.通过正交实验的统计学方法得到了最适修饰条件.研究发现,PEG化后的rhG-CSF具有了更高的体外稳定性,其体内活性也得到了很大提高,体内作用时间得到很大延长.因此,对于rhG-CSF的N端氨基定点PEG化修饰,可以显著提高rhG-CSF的临床应用价值.

清蛋白作为药物载体的PEG化修饰研究进展

清蛋白(白蛋白)是一种理想的药物载体,但由于其在体内半衰期短以及易被酶降解等缺点限制了其应用,然而根据其具有多个修饰位点的结构特点,可通过PEG修饰延长循环时间,阻碍酶的作用等。目前,PEG修饰清蛋白仍处于研究阶段,已有较多关于PEG修饰清蛋白的研究,例如PEG修饰所起的作用、对清蛋白及其制剂的影响,以及修饰位点的选择等。本文对清蛋白的PEG化修饰的相关研究进行综述。

PEG化青霉素降低红细胞溶血的研究

目的采集葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷的动物模型血液,评价PEG化青霉素降低红细胞溶血的作用。方法 1%乙酰苯肼皮下注射大鼠制备G6PD缺陷的动物模型,取其红细胞制成混悬液,比较青霉素和PEG化青霉素的溶血作用,以及两组的红细胞脆性、红细胞膜流动性。结果青霉素组出现明显的红细胞溶血,且随着浓度变化和孵育时间延长溶血具有增加的趋势,溶血率高达25%,而PEG化青霉素组未见明显溶血;另外,红细胞脆性实验结果表明,PEG化青霉素对红细胞膜的作用非常轻微,H50%为43.6%,显著低于青霉素组(52.9%);红细胞膜流动性结果表明,PEG化青霉素对红细胞膜的流动性影响非常轻微。结论 PEG化青霉素的溶血率较低,为该药的体内研究和进一步新型药物制剂开发奠定基础。

PEG化重组人白细胞介素-6制品游离PEG测定方法的研究

为了建立PEG化学修饰的重组人白细胞介素-6(PEG-rhIL-6)的部分质量控制方法,参照2005年版《中华人民共和国药典》三部附录III B高效液相色谱法,以RP-HPLC方法分离PEG-rhIL-6原液中的不同成分,用蒸发光散射监测器检测游离PEG,用外标法测定计算样品中残留PEG的含量。PEG修饰rhIL-6结构稳定;制品中的游离PEG含量符合要求。RP-HPLC法检测游离PEG结果可靠。

PEG化壳聚糖葫芦素B纳米混悬剂的制备及其冻干粉药动学评价

目的采用PEG化壳聚糖制备葫芦素B纳米混悬剂(cucurbitacin B nanosuspensions,CuB-NPs),考察CuB-NPs冻干粉口服吸收生物利用度。方法反溶剂-高压均质法制备CuB-NPs,单因素实验结合Box-Behnken设计-效应面法(BoxBehnken design-response surface methodology,BBD-RSM)优化CuB-NPs处方。测定粒径、多分散指数(polydispersity index,PDI)及ζ电位等,透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察CuB-NPs微观形态。采用5%乳糖作为冻干保护剂制备冻干粉,X射线粉末衍射(X-ray powder diffraction,XRPD)法分析晶型,透析法考察CuB-NPs冻干粉在p H2.0和pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中的释药行为。ig给予SD大鼠葫芦素B和CuB-NPs冻干粉,测定血药浓度,计算口服相对吸收生物利用度。结果CuB-NPs最佳处方工艺:葫芦素B与PEG化壳聚糖用量比例为1.95∶1,均质压力为100 MPa,均质次数为11次。CuB-NPs粒径为(265.71±13.46)nm,PDI值为0.116±0.012,ζ电位为(33.14±1.39)m V。CuB-NPs微观形态为球形,葫芦素B在CuB-NPs冻干粉中结晶度下降。CuB-NPs在pH 2.0和pH 7.4 PBS中2 h溶出度均大于90%,溶解度提高至58.58倍。药动学显示,新制备CuB-NPs和加速条件下储存6个月后相对生物利用度分别为4.87倍和4.48倍,药动学参数之间无显著性差异。结论CuB-NPs提高了葫芦素B的溶解度及溶出度,稳定性良好,有效促进了口服吸收。

PEG化葛根素在急性心肌缺血模型大鼠上的组织分布

为了探索PEG化葛根素在急性心肌缺血模型大鼠上的组织分布特点,采用健康雄性SD大鼠60只,随机分成两组,每组30只,均静脉注射给予PEG化葛根素,剂量为488 mg·kg-1,给药5 min后,一组设为正常大鼠,另一组大鼠腹腔注射给予异丙肾上腺素(剂量为50 mg·kg-1),造成急性心肌缺血模型。分别于给药后30、60、90、120、150和180 min处死部分动物,取心、肝、脾、肺、肾、脑组织脏器,利用HPLC测定各组大鼠组织脏器中葛根素的浓度。结果显示,PEG化葛根素在正常大鼠脏器中AUC大小顺序为肝>肾>心≈脾>肺>脑,而在急性心肌缺血模型大鼠中AUC大小顺序为肝≈心>肾>肺≈脾>脑,其中,在模型大鼠心脏中AUC为正常大鼠心脏中的1.7倍,且存在显著性差异(P<0.05)。结果表明,PEG化葛根素在心肌梗死早期区域具有较好的心脏靶向性,可以将药物蓄积于缺血心肌,为该药的进一步研究开发和临床应用提供重要的参考依据。

PEG化重组人促红素质量控制方法和标准研究

目的:建立PEG化重组人促红素质量控制方法和质量标准。方法:用正常小鼠网织红细胞计数法测定体内生物学活性,使用iCE毛细管等电聚焦电泳分析异构体,用离子色谱确定N-糖链指纹图谱,反相HPLC进行Lys-C蛋白内切酶酶切的肽图分析以及纯度测定。其余检测项目按2010年版中国药典三部方法进行。结果:建立的方法经过比较和对PEG化重组人促红素的检测,结果稳定可靠,重复性好,各指标符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2010年版中国药典三部的要求。结论:本研究建立了一套完善的PEG化重组人促红素质量控制体系。

PEG化葛根素降低红细胞溶血的体内研究

目的探讨PEG修饰技术降低葛根素诱导红细胞溶血的体内研究。方法采用葛根素注射液和PEG化葛根素给予家兔每天等剂量静脉注射,连续7 d,每天取血3 mL,进行血细胞计数分析;7 d实验结束后再取血,检测红细胞渗透脆性和红细胞膜流动性。结果血细胞计数分析结果表明,PEG化葛根素组家兔的血细胞计数与空白对照组没有显著性差异,而葛根素注射液组家兔出现了血管内溶血现象;红细胞渗透脆性和红细胞膜流动性结果表明,PEG化葛根素可以降低红细胞渗透脆性和增强红细胞膜流动性。结论 PEG修饰技术可以减轻葛根素诱导血管内溶血的不良反应,更安全。

PEG化葛根素在不同贮藏条件下的稳定性研究

目的:考察聚乙二醇(PEG)化葛根素的稳定性,为PEG化葛根素贮藏条件提供实验依据。方法:首先建立PEG化葛根素的含量测定方法,再采用不同温度、湿度,光照和避光等影响因素对PEG化葛根素的稳定性进行系统研究。结果:PEG化葛根素在温度较高,湿度较大,光照条件下降解严重,尤其在光照条件下,其降解现象非常显著,其次为温度。结论:PEG化葛根素贮藏需采用低温冷藏、避光并干燥的环境。

PEG化呋喃二烯固体脂质纳米粒的制备及体外巨噬细胞摄取研究

目的:研究PEG化呋喃二烯固体脂质纳米粒(PEG-FDE-SLN)的制备方法,并考察其理化性质及细胞摄取性能。方法:实验采用乳化蒸发-低温固化法制备PEG-FDE-SLN,以粒径、Zeta电位、多分散系数、包封率为评价指标,通过单因素考察选择制备PEG-FDE-SLN的最佳处方。以小鼠腹腔巨噬细胞(MPM)为模型做体外细胞摄取实验。结果:制备PEG-FDE-SLN的最佳处方为固态脂质单硬脂酸甘油酯100 mg,液态脂质中碳链三酰甘油40 mg,乳化剂蛋黄卵磷脂13 mg,聚乙二醇硬脂酸酯150 mg,制备的样品粒径为(272.9±2.4)nm,多分散系数为(0.193±0.022),Zeta电位为(-19.82±0.52)mV。包封率为(90.0±1.0)%。体外细胞摄取实验证明,MPM对FDE-SLN的摄取随着聚乙二醇硬脂酸酯的加入以及PEG相对分子质量的增加而逐渐减小,以PEG5000-FDE-SLN摄取最少为(8.4±0.4)%。结论:本实验制备的PEG-FDE-SLN,能够改善巨噬细胞对FDE-SLN的摄取作用,PEG链长度影响MPM对FDE-SLN的摄取作用,PEG链越长MPM摄取越少。

氧化石墨烯PEG化后对L929细胞毒性的影响

目的研究氧化石墨烯(GO)PEG化前、后对L929细胞毒性的影响。方法将羧基化后的GO分子通过酰胺键与双端氨基聚乙二醇4000(NH2-PEG4000-NH2)结合,用细胞染色法来考察小鼠成纤维细胞(L929)与GO或GO-PEG一同孵育后生存率与黏附性的变化,从而比较GO分子PEG化前、后细胞毒性的变化。结果成功制备了PEG化氧化石墨烯,在相同给药浓度与孵育时间的条件下,L929细胞与经过PEG4000修饰的GO分子孵育后的相对生存率与细胞毒性明显大于未经修饰者。结论 PEG化可显著降低GO的细胞毒性并减少对细胞黏附性的影响,其作用机制可能是因为PEG化可以通过拮抗细胞内氧化应激损伤而降低GO的细胞毒性。GO-PEG可以作为一种安全的药物载体运用于载药系统中。

重组猪尿酸氧化酶PEG化修饰的影响因素考察

目的:考察mPEG-SC与重组猪尿酸氧化酶(recombinant porcine urate oxidase,rPUOX)摩尔比值,碳酸缓冲液pH值和浓度,以及酶浓度对rPUOX PEG化的影响。方法:用mPEG-SC对纯化rPUOX进行PEG化修饰。通过酶残余活力测定和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对修饰效果进行评估。结果:随着mPEG-SC/rPUOX摩尔比值的提高,修饰程度也提高。在pH 10.1及其以下的碳酸缓冲液中rPUOX修饰不充分,pH 10.5修饰效果最好,pH 11.6效果下降。碳酸缓冲液为0.02 mol.L-1时,rPUOX溶解不完全,0.06和0.1mol.L-1的溶解和修饰均比较理想,0.1 mol.L-1溶液中rPUOX残余活力较高。摩尔比值相同的条件下,随着酶浓度的提高修饰效果也提高,5 mg.mL-1的酶浓度更加适合修饰反应。结论:优化的rPUOX PEG化的条件是:mPEG-SC/rPUOX摩尔比值为18.6倍;碳酸缓冲液的pH值为10.5,浓度为0.1 mol.L-1;酶质量浓度为5 mg.mL-1。