聚乙二醇化重组人生长激素长效作用及在体生物活性研究

目的:观察聚乙二醇化重组人生长激素(PEGGH)在去脑垂体大鼠体内的(invivo)促进生长的生物活性功能和长效药理作用。方法:以摘除脑垂体的大白鼠为动物模型,PEGGHd1一次给药;rhGH(国家标准品)作为阳性对照,每天给药一次,连续6d,使总剂量与PEGGH一致。同时设模型组(去脑垂体大鼠),只给予0.1%牛血清白蛋白的生理盐水,d7处死大鼠,检测指标为:体重增加、尾长增长、胫骨骨骺板宽度和肝脏重量。结果:实验结果显示,与模型组比,PEGGH一次给药各剂量组体重显著增加(P<0.01),尾长也显著增长(P<0.01),胫骨骨骺板宽度显著增宽(P<0.01),中、高剂量组肝脏重量增加(P<0.01),并都具有量效关系;其促进动物生长的生物活性与每天给药的rhGH比没有差别(P>0.05),具有长效的作用,其中4.3、8.6IU·kg-1所至生物活性大于多次给药的普通rhGH8.6IU·kg-1效果;本批供试品测得生物效价为5.0IU·mg-1,比普通rhGH高1倍。结论:本批供试品PEGGH用药次数少、药效持续时间长,比普通rhGH具有更高的促进动物机体生长的生物活性。

聚乙二醇化重组人生长激素的免疫原性及药动学研究

目的研究聚乙二醇化重组人生长激素的免疫原性及药动学。方法用rhGH及其两种mPEG修饰物PGH1、PGH2免疫家兔,检测兔血清中的抗体滴度;对家兔单次背部皮下给药,定时取血清,建立rhGH及其修饰物的ELISA双抗夹心检测法,检测血清中的药物浓度,并计算药动学参数。结果经过mPEG修饰后,明显降低了rhGH的抗体滴度,缩短了抗体持续时间。在药动学研究中发现,其t1/2β从3.1h显著延长到PGH1的9.9h和PGH2的22.5h,其AUC也有很大的提高。结论mPEG修饰后可明显降低rhGH的免疫原性,延长药物在动物体内的半衰期,降低清除率,改善其药动学性质。且改善程度随mPEG相对分子质量的增大而增强。

多种PEG化重组人生长激素中蛋白含量测定的通用型方法的建立

目的：通过以未修饰的原型蛋白为对照品,建立准确测定多种聚乙二醇化重组人生长激素（PEG-rhGH）中蛋白含量的通用型方法。方法：采用rhGH国家对照品和凝胶色谱法测定PEG-rhGH中的蛋白含量。通过详细的专属性、精密度、准确性等方法学考察,建立该方法。色谱条件：采用TSKGel 3000SWxl（300 mm×7.8mm）凝胶色谱柱,以0.05 mol·L-1的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠（pH7.0）为流动相,流速为0.6 mL·min-1,柱温为室温,检测波长为280 nm。通过将测定结果与申报企业原有方法测定结果进行比对,对现有含量测定方法进行评价。结果：由于PEG与蛋白质之间的连接子存在双键,在214 nm下,3种PEG-rhGH的测定结果的准确性较差,平均回收率（n=9）分别为109.3%、109.9%、110.6%;而在280 nm下,rhGH在200-1800μg·mL-1浓度范围内线性关系良好（r=0.9999）,3种PEG-rhGH的平均回收率（n=9）分别为101.2%、101.7%、100.4%。结果比对中发现,新建方法与企业申报方法中采用同质对照品的HPLC法测定结果相当,但与以BSA为对照品的Lowry法测定结果相差较大。结论：本方法专属性、精密度和准确性良好,可作为多种PEG-rhGH含量测定的通用型方法。

聚乙二醇化重组人生长激素对去垂体幼鼠胰岛分泌的影响及其机制

目的观测长效生长激素聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)是否引起胰岛素抵抗及其与短效生长激素注射用重组人生长激素(rhGH)的差异。方法 3周龄SD雄性幼鼠106只,随机取88只进行去垂体手术造模,取成模的幼鼠54只分为模型组、rhGH组、PEG-rhGH组,另18只假手术组为对照组。分别给予生理盐水(0.25 mg·kg-1·d-1)、rhGH(0.25mg·kg-1·d-1)、PEG-rhGH(1.4 mg·kg-1·周-1)处理。4周后进行糖耐量实验和胰岛素释放试验,计算胰岛素曲线面积与葡萄糖曲线面积比值,胰岛素稳态模型(HOMA-IR);检测血清生长抑素水平;免疫组织化学法检测胰岛胰岛素(INS)、胰高血糖素(GLU)、生长抑素(SS)、胰多肽(PP)。结果 PEG-rhGH组HOMA-IR较对照组、模型组低(P<0.05),与rhGH组比较无差异。AUCI/AUCG值组间比较显示PEG-rhGH组高于rhGH组,但无统计学差异。PEG-rhGH组GLU蛋白表达与模型组表达无差异。PEG-rhGH组INS表达较模型组表达上升(P<0.05)。PEG-rhGH组SS、PP表达与rhGH无差异。血清SS各组间均无明显差异。结论未观察到PEG-rhGH引起去垂体大鼠胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌能力下降,对胰岛分泌蛋白的表达无明显影响。

液相肽图法推断聚乙二醇化重组人生长激素的聚乙二醇修饰位点研究

目的利用液相肽图法对聚乙二醇(PEG)化重组人生长激素(rhGC)(PEG-rhGH)的聚乙二醇修饰位点进行测定。方法通过优化酶切条件,建立肽段分离度高、信息完整的液相肽图方法。继而通过引入高分辨率质谱,对重组人生长激素的液相肽图准确定性。最后通过比较发生改变的修饰前后的肽段,推断聚乙二醇的修饰位点。结果 3个厂家的聚乙二醇化重组人生长激素中发生较为明显修饰的肽段有5个,分别为T1(N-end)、T4(lys38)、T13(lys140)、T14(lys145)及T15(lys158)。结论液相肽图法可用于对结构复杂、不均一性较高的多位点异构体聚乙二醇修饰药物的位点测定。

长效重组人生长激素治疗儿童生长激素缺乏症的有效性及安全性研究

目的比较长效聚乙二醇重组人生长激素(PEG-rhGH)和短效重组人生长激素(rhGH)治疗对生长激素缺乏症(GHD)患儿的有效性和安全性。方法 50例GHD患儿中20例给予0.2 mg/(kg·周) PEG-rhGH治疗(长效组);30例给予0.03 mg/(kg·d)短效rhGH治疗(短效组),疗程为56周。分别在治疗前、治疗后16、28、56周评价两组患儿的身高、年生长速率、身高标准差积分(HTSDS)、骨龄(BA)、血清胰岛素样生长因子1(IGF-1)及甲状腺功能、空腹血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白、血脂和胰岛素抵抗(IR)。结果长效组和短效组的生长速度在治疗28周时较治疗前均显著提高(P<0.05)[长效组:(3.67±0.81)cm/年至(14.05±2.30)cm/年,短效组(3.39±1.36)cm/年至(13.63±2.32) cm/年],长效组较短效组提高更明显(t=2.114,P<0.05);治疗至56周长效组和短效组的生长速度分别为(10.98±1.01)cm/年和(10.77±1.48)cm/年,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗第16周起两组患儿的HTSDS较治疗前出现显著改善(P<0.05),逐渐接近正常水平。从治疗第4周开始长效组HTSDS改善明显优于短效组(P<0.05),在观察过程中一直持续存在。两组患儿在治疗后IGF-1 SDS逐渐提升,至治疗16周开始较基线水平有显著提高(P<0.05)。疗程至28周开始长效组IGF-1 SDS较短效组在正常范围内显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患儿在56周的治疗中均未见严重不良反应。结论 PEG-rhGH对儿童GHD治疗有效,效果优于短效rhGH,未见严重不良反应。

荧光胺衍生化法测定3种聚乙二醇化重组人生长激素的平均修饰率

目的:通过对游离氨基进行荧光胺衍生化,测定3种不同结构聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)的平均修饰率。方法:采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定PEG-rhGH的相对分子质量,求得理论平均修饰率。通过激发波长与发射波长的选取、正交试验、游离PEG干扰试验、反应稳定性考察等方法学考察,建立荧光胺衍生法测定PEG-rhGH平均修饰率。结果:从质谱法可知PEG-rhGH的理论修饰度为10%。方法学考察结果显示,激发波长与发射波长分别为390 nm与480 nm,溶液pH对试验结果的影响最大,低浓度的PEG对试验结果无干扰,在反应开始8 min之内荧光强度稳定。荧光胺法测得3种不同结构PEG-rhGH的修饰度分别为8.8%、9.8%及9.5%,与理论值接近。结论:荧光胺法可作为测定PEG-rhGH平均修饰率的方法,3种PEG化重组人生长激素的平均修饰率为10%。