PEG10对人类绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞增殖和凋亡影响的初步研究

目的初步研究父系表达印记基因PEG10低表达对人类绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞增殖和凋亡的影响。方法构建4组PEG10干扰载体[si-898、si-1854、si-1951及对照(si-NC)],然后转染到HTR-8/Svneo细胞株并进体外培养,si-NC组为对照组。流式细胞术检测HTR-8/Svneo细胞的细胞周期和细胞凋亡,qRT-PCR检测Cytochrome C、Caspase3、Bid、Bak、Bax及Cyclin D1 mRNA的表达情况,MTT法检测细胞增殖活力。结果与对照组比较,转染3组siRNA片段均能显著抑制PEG10基因的表达(P<0.05),其中si-898、si-1854抑制作用更显著(P<0.01)。转染si-898或si-1854的HTR-8/Svneo细胞Cytochrome C、Caspase3、Bid、Bak、Bax mRNA的表达显著升高(P<0.01),而Cyclin D1 mRNA的表达显著降低(P<0.05),并且细胞凋亡率也显著高于对照组(P<0.05)。MTT法检测细胞增殖活力显示,与对照组相比,干扰PEG10基因后细胞在48 h和72 h的增殖活力也显著降低(P<0.05)。流式细胞术检测显示,干扰PEG10基因后细胞周期阻滞在G1期。结论干扰PEG10基因能诱导人类绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞凋亡,降低细胞增殖活力,阻止细胞周期从G1期到S期的转化进程,导致细胞周期阻滞。

PEG10基因在不同转移潜能肝癌细胞中表达的定量分析

目的通过对不同转移潜能的肝癌细胞株中PEG10基因(parternal express gene 10)表达水平的定量分析,探讨其作为肝癌转移基因的可能性。方法提取肝癌细胞株HepG2、MHCC-97L、MHCC-97H的RNA,反转录合成第一链cDNA,对反转录产物进行荧光定量PCR。用管家基因-βactin的cDNA起始浓度作为参照标化PEG10的cDNA起始浓度,对标化结果进行方差分析。结果HepG2、MHCC-97L、MHCC-97H标化后的PEG10 cDNA相对起始浓度分别为(3.15±0.05)×10-3(、5.06±0.03)×10-3(、6.14±0.09)×10-3,各肝癌细胞系之间PEG10表达量差异也存在极显著性意义(P<0.01)。结论PEG10基因表达水平与肝癌细胞的转移潜能呈正相关,可以推测PEG10基因可能是促使肝癌转移的癌基因。

难免流产蜕膜组织遗传印记基因PEG10的表达

采用半定量逆转录聚合酶反应(RT-PCR)、原位杂交、免疫印记(Western blot)及免疫组织化学技术检测了36例难免流产患者蜕膜组织PEG10(Paternally expressed gene10)mRNA及蛋白的表达与分布,并以36例同期正常早孕妇女为对照,研究遗传印记基因在难免流产蜕膜组织中的表达,探讨其在自然流产中的作用。RT-PCR结果显示,PEG10在两组蜕膜组织中均有表达,正常妊娠组平均表达水平为0.5994±0.049,难免流产组为0.1783±0.037,两组比较具有显著性差异(P<0.05)。原位杂交、免疫组化及Western blot分析也显示PEG10的表达规律与RT-PCR结果相吻合。研究结果表明,遗传印记基因PEG10维持一定水平的表达对早期胚胎发育和正常妊娠的维持有重要意义,而其表达下调可能是导致难免流产的原因之一。

转基因克隆牛胎盘中印迹基因PEG10的DNA甲基化水平

低效率的体细胞核移植技术显著制约着该技术在转基因动物生产上的广泛应用。目前认为供体细胞核不能被受体卵母细胞胞质完全的表观重编程是其效率低下的最主要原因,而DNA甲基化是基因表观修饰的主要方式之一。为了探求转基因克隆牛的死亡是否与其胎盘中印迹基因的甲基化的重编程程度相关,文章通过亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)和亚硫酸氢盐联合限制性内切酶分析法(Combined bisulfite restriction analysis,COBRA),对印迹基因PEG10在围产期死亡且存在发育缺陷的转基因克隆牛的胎盘(死亡组)和存活的转基因克隆牛的胎盘(存活组)与正常对照牛胎盘(对照组)的DNA甲基化水平进行了详细的比较。结果发现,与对照组相比,PEG10基因在死亡组上表现出异常的超甲基化水平,而存活组与对照组相比无显著性差异。研究结果显示,胎盘中印迹基因的DNA甲基化表观重编程不彻底可能是导致转基因克隆牛发育异常进而死亡的主要原因之一。

肝细胞癌组织中PEG10、SIAH2的表达及其意义

目的探讨遗传印记基因PEG10(paternally expressed gene 10,PEG10)与泛素连接酶SIAH2(seven in absentia homologs 2,SIAH2)在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化SP法检测50例HCC和相应癌旁组织中PEG10、SIAH2蛋白的表达。结果 (1)PEG10和SIAH2在肝癌组织中的阳性率分别为84%和78%,高于相应癌旁组织中的阳性率8%和14%,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)PEG10和SIAH2表达与肿瘤TNM分期有相关性(P<0.01),但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、血清HbsAg、AFP水平、是否伴肝硬化无相关性(P>0.05)。(3)HCC中PEG10、SIAH2蛋白表达呈正相关(r=0.42,P<0.01)。结论 PEG10、SIAH2表达与HCC的发生、发展具有明显相关性。

苦参碱对人肝癌细胞HepG2凋亡和PEG10表达的影响

目的:观察苦参碱(MAT)对人肝癌HepG2细胞凋亡及对PEG10表达的影响。方法:用MTT法检测不同质量浓度的MAT作用HepG2细胞后对细胞增殖的影响;JC-1染色流式细胞术检测对细胞线粒体膜电位的影响;RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测对PEG10基因和蛋白水平的表达变化。结果:MAT质量浓度≥0.1 g/L时有抑制HepG2细胞增殖的作用,且作用随药物质量浓度的增加及时间的延长而加强(P<0.01);JC-1染色流式细胞术检测分析显示MAT作用前后HepG2细胞线粒体膜电位下降明显(P<0.01);RT-PCR及免疫细胞化学结果显示,经MAT处理后,PEG10的基因和蛋白表达水平均下调。结论:苦参碱能有效抑制PEG10的表达,且能抑制HepG2细胞增殖并可通过改变线粒体膜电位诱导细胞凋亡。

靶向遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体。方法根据PEG10基因cDNA序列,设计针对目的基因的4个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论本研究成功构建针对PEG10的真核表达载体,可能成为肝癌基因治疗中的一种新型、高效的治疗载体。

PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体,体外观察其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响.方法:设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列,构建真核表达载体siRNA1,siRNA2和siRNA3,脂质体分别转染HepG2细胞后实时定量PCR,检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的影响,MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡.结果:成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体.它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达,以siRNA2抑制效率最高,可达93.99%.HepG2细胞的生长也明显受到抑制(P<0.05),大量HepG2细胞凋亡,siRNA2凋亡率最高,为66.91%.结论:靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长,诱导细胞凋亡,该作用与降低PEG10基因的表达有关.

PEG10基因siRNA真核表达载体对HepG2细胞周期的影响

目的观察针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体对人肝癌HepG2细胞周期及细胞周期调控蛋白表达水平的影响。方法以脂质体法将psiRNA-PEG10真核表达载体转染HepG2细胞,RT-PCR检测PEG10 mRNA的表达,流式细胞仪观察细胞周期分布的变化;RT-PCR和Western Blotting法分别检测细胞周期调节蛋白D1(CyclinD1)和P27 mRNA和蛋白水平的表达变化。结果RT-PCR结果显示,转染psiRNA-PEG10的HepG2细胞中PEG10 mRNA的表达明显降低;流式细胞仪检测发现,与未转染组和空载体组相比,转染psiRNA-PEG10后处于G0/G1期的HepG2细胞百分比明显升高(P<0.01),而G2/M期的细胞百分比明显降低(P<0.01);在mRNA和蛋白水平上,转染psiRNA-PEG10的细胞CyclinD1表达明显降低;而P27表达明显升高(P<0.01)。结论PEG10可通过影响细胞周期调控蛋白CyclinD1和P27表达,干扰肿瘤细胞的细胞周期发挥抗瘤作用,针对PEG10的siRNA真核表达载体有望成为研究肝癌治疗的有力工具。

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肝癌细胞HepG2凋亡及其PEG10基因表达的影响

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞系HepG2凋亡及其PEG10基因表达调控的影响,进一步探讨肝癌的发病机制及5-Aza-CdR治疗肝癌的可行性。方法用浓度为50μmol/L的5-Aza-CdR分别处理HepG2细胞24、48、72 h,hoechst 33342/PI双染荧光显微镜检测HepG2细胞凋亡情况。RT-PCR、Western blot法分别检测PEG10 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比,5-Aza-CdR作用24、48、72 h后,HepG2细胞的凋亡率明显升高,PEG10 mR-NA和蛋白表达水平显著下降,并呈现时间依赖性(P<0.05)。结论 5-Aza-CdR可促进HepG2细胞凋亡并抑制PEG10基因的表达。

印迹基因PEG10在胃腺癌组织中的表达及意义

目的:研究印迹基因PEG10在胃癌及癌旁组织中的表达情况,探讨其对胃癌细胞生长的影响。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例胃癌、癌旁组织及6例正常胃组织中印迹基因PEG10mRNA表达;构建表达PEG10质粒,并将其转染到不表达内源性PEG10的胃癌细胞系MKN45中,应用噻唑蓝比色分析法(MTT),测定转染PEG10后MKN45细胞的生长情况。结果:20例胃癌组织中9例(45.0%)PEG10表达阳性,对应的癌旁组织仅有2例(10.0%)表达阳性,2组间PEG10表达率比较差异有显著性(P<0.05),正常胃组织无PEG10表达;胃癌细胞系MKN45无内源性PEG10表达,经质粒转染PEG10基因后的MKN45细胞的生长速度加快。结论:印迹基因PEG10在胃癌组织中高表达,具有促进胃癌细胞生长的作用。

PEG10基因在肝细胞肝癌中表达及其与凋亡的关系

目的:研究PEG10基因在肝细胞肝癌(HCC)中的表达及其与凋亡的相互关系,探讨其在HCC发生发展中的作用及意义。方法:应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法定性测定43例HCC及对应癌旁组织中PEG10 mRNA的表达情况,TUNEL法原位检测HCC组织中的凋亡癌细胞并计算凋亡指数(AI)。结果:HCC细胞中PEG10 mRNA的阳性表达率明显高于对应的癌旁组织(P<0.01);PEG10 mRNA的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤大小无关(均为P>0.05);但与肿瘤的分期分级、分化程度、浸润转移、门静脉有无癌栓、血清中甲胎蛋白水平、是否合并HBV感染有关(均为P<0.05);AI在PEG10表达阳性与阴性组间差异有显著性(P<0.01)。结论:PEG10在HCC中过度表达,抑制肝癌细胞凋亡,可能在HCC的发生发展中起着重要作用。

肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10转基因载体的构建和鉴定

目的构建小鼠肝脏特异性表达人遗传印记基因PEG10的转基因载体pALB-PEG10-EGFP,为制备转基因小鼠做准备。方法RT-PCR扩增PEG10基因cDNA序列,克隆入T载体进行酶切、测序鉴定,后将其定向克隆至真核表达载体pALB-EGFP中ALB的下游,构建转基因载体pALB-PEG10-EGFP;在Lipofectamine介导下转染L02细胞,经G418抗性筛选,挑选阳性克隆并扩大培养;采用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学等方法分析PEG10在L02细胞中的表达和细胞内定位。结果酶切和测序结果表明pALB-PEG10-EGFP构建成功;稳定转染后的L02表达有PEG10的mRNA及蛋白,且主要定位于胞浆。结论重组体pALB-PEG10-EGFP的构建初步奠定了转基因小鼠制备的基础。

遗传印记基因PEG10沉默对人肝癌细胞Wnt/β-catenin信号转导通路的影响

目的观察靶向封闭遗传印记基因PEG10对人肝癌细胞(HepG2)Wnt/β-catenin信号转导通路的影响,探讨PEG10促进肝癌形成的可能机制。方法设计针对PEG10基因的shRNA,体外转录制备shRNA后利用脂质体转染技术转染肝癌细胞株HepG2,RT-PCR检测PEG10、β-catenin(CTNNB1)、WNT1基因mRNA水平,应用免疫组化技术检测其蛋白表达水平。结果转染PEG10-shRNA后HepG2细胞PEG10 mRNA水平下降65.6%,其蛋白表达水平减少60.9%;同时,β-catenin(CTNNB1)、WNT1基因mRNA水平随之分别下降52.5%、96.1%,蛋白表达水平分别减少94.3%、63.2%。结论靶向封闭PEG10可下调肝癌细胞Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin(CTNNB1)、WNT1表达水平。PEG10对肝癌的促进作用可能部分与其影响Wnt/β-catenin通路有关。

遗传印记基因PEG10在结肠癌中的表达及意义

目的研究遗传印记基因PEG10在结肠癌、癌旁组织、正常结肠组织中的表达及意义。方法收集中国人民解放军第一七四医院2015年1月-2015年9月40例结肠癌、癌旁组织,20例正常结肠组织标本,通过免疫组织化学及蛋白印迹法检测PEG10的细胞定位及其表达差异。结果 PEG10细胞主要分布于细胞质,在结肠癌中呈过表达,其表达明显高于癌旁组织、正常结肠组织,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 PEG10可能参与结肠癌发生、发展,但其具体作用机制仍需进一步探讨。

FGR的胎盘组织印记基因PEG10DNA甲基化水平及其意义

目的通过检测父方表达印记基因PEG10 DNA在胎儿生长受限(FGR)患者胎盘组织甲基化水平,探索FGR是否与其胎盘中印记基因的甲基化程度相关。方法采用前瞻性研究,收集2014年1月至2017年1月在上海市第一人民医院宝山分院妇产科住院分娩的FGR者56例(研究组)和同期正常单胎晚孕分娩者56例(对照组),采用亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测研究组和对照组胎盘组织的PEG10 DNA甲基化水平,分析其甲基化水平与FGR的临床病理关系。结果 FGR胎盘组织印记基因PEG10表现为异常甲基化水平,与对照组相比,研究组胎盘组织印记基因PEG10 DNA甲基化水平在CPG岛1无明显差异,而在CPG岛2及CPG岛3明显高于对照组(t值分别为94.97,7.16,均P<0.05),尤其以CPG岛2最为明显(研究组表达为0.544±0.027,对照组表达为0.152±0.015)。结论胎盘组织父方表达的印记基因的DNA甲基化水平可能是导致FGR发病的原因之一。

PEG10在人肺癌细胞系A549增殖及侵袭迁移过程中的作用

目的通过应用RNAi技术沉默肺癌细胞系A549中的PEG10基因,探讨PEG10在肺癌细胞系A549细胞增殖及侵袭迁移过程中的作用。方法 RPMI-1640培养肺癌A549细胞。瞬时转染及建立稳定转染shRNA PEG10细胞系;MTT及软琼脂克隆形成实验检测PEG10基因沉默对A549肺癌细胞增殖的影响;细胞划痕试验和Transwell小室方法观察PEG10基因沉默对A549肺癌细胞迁移能力的影响;逆转录RT-PCR、实时定量qRT-PCR及Western blot检测PEG10、β-catenin和其下游分子cmyc、MMPs、twist、E-cadherin、Vimentin表达水平的变化。结果 PEG10干扰效率达65%;转染后肺癌细胞划痕愈合速度变慢;穿过Transwell小室的细胞数减少;克隆形成数目也降低,同时检测到β-catenin及c-myc、MMPs、twist、Vimentin表达水平降低,E-cadherin表达水平升高。结论靶向封闭PEG10基因可下调Wnt/β-catenin信号通路的关键因子β-catenin的表达水平,降低肺癌A549细胞增殖、侵袭及迁移能力,部分逆转肺癌上皮间质转化。

印迹基因PEG10在胃癌中的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系

目的探讨印迹基因PEG10在胃癌组织中的表达特点及其与幽门螺杆菌(Hp)感染的关系。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例胃癌、癌旁组织中印迹基因PEG10的mRNA水平;采用免疫组织化学染色技术及Warthin-Starry银染法检测42例胃癌、癌旁组织及6例正常胃组织中PEG10蛋白的表达及Hp感染情况。结果RT-PCR结果显示20例胃癌组织中9例(45.0%)PEG10mRNA表达,对应的癌旁组织仅有2例(10%)表达;免疫组织化学染色结果显示42例胃癌组织中22例(52.38%)PEG10蛋白表达阳性,对应的癌旁组织仅有5例(11.90%)PEG10蛋白表达阳性,正常胃组织无PEG10蛋白表达;Hp银染法结果显示42例胃癌组织中25例(59.52%)为Hp感染阳性,癌旁组织20例(47.62%)Hp感染阳性;22例PEG10阳性表达胃癌组织中20例Hp感染阳性。结论PT-PCR结果与免疫组织化学染色结果具有一致性,即PEG10mRNA及蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达率比较差异有显著性(P<0.05);PEG10在胃癌组织中的表达与Hp感染呈正相关(P<0.05)。

PEG10在重度子痫前期患者胎盘组织中的表达及临床价值

目的 探讨印记基因PEG10在重度子痫前期（SPE）患者胎盘组织中的表达及临床价值。方法 选取2013年4月至2015年3月分娩以及因故中止妊娠的145位孕母作为研究对象,按照孕周和孕期发作SPE情况将研究对象分为4组：早发SPE组33例,早期健康组35例,晚发SPE组37例,晚期健康组40例。采集孕母胎盘组织制成切片,免疫组化法进行附染并检视PEG10蛋白表达情况,CMIAS病理图像分析软件测定吸光度A并比较。结果PEG10蛋白在4组滋养层细胞膜和胞浆均有表达。早发SPE组PEG10蛋白表达强度明显高出早期健康组,晚发SPE组PEG10蛋白表达强度远远超出晚期健康组（P〈0.01）;晚发SPE组表达值较早发SPE组小幅偏低,但差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 胎盘组织中PEG10的高水平表达可能与SPE的发病有关。