PEP-1-VP3融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法:通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体pET15b-PEP-1,构建重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达PEP-1-VP3融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲和层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功构建PEP-1-VP3融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了分子量为17.6kD的PEP-1-VP3融合蛋白。结论:PEP-1-VP3融合蛋白原核表达质粒的构建及目的蛋白的表达、纯化,为体内应用PEP-1-VP3融合蛋白进行抗肿瘤研究提供了理论基础。

PEP-1-VP3融合蛋白的分离纯化与初步鉴定

目的构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体p ET15b-PEP-1中,构建重组表达质粒p ET15b-PEP-1-VP3,经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达PEP-1-VP3融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲和层析,进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果成功构建PEP-1-VP3融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了17.6k D的PEP-1-VP3融合蛋白。结论所构建的PEP-1-VP3融合蛋白为体内抗肿瘤研究提供了理论基础。

靶向克隆法构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体

目的利用PCR产物靶向克隆法构建细胞穿透肽-凋亡素(PEP-1-VP3)的原核表达载体。方法以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板,PCR扩增VP3基因的366bp片段,应用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性pET15b-PEP-1,得到重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行NdeⅠ和BamHⅠ双酶切图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体。结果 PCR产物经过电泳可见366bp特征性的VP3片段,重组的质粒经过双酶切获得了一个大小为440bp的特征性PEP-1-VP3片段,重组质粒测序证实VP3cDNA编码区成功地克隆入了pET15b-PEP-1,且其序列与GeneBank中VP3cDNA序列完全一致。结论靶向克隆法可快速、高效地构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体,为制备PEP-1-VP3融合蛋白奠定基础。