PEP-1-VP3融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法:通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体pET15b-PEP-1,构建重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达PEP-1-VP3融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲和层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功构建PEP-1-VP3融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了分子量为17.6kD的PEP-1-VP3融合蛋白。结论:PEP-1-VP3融合蛋白原核表达质粒的构建及目的蛋白的表达、纯化,为体内应用PEP-1-VP3融合蛋白进行抗肿瘤研究提供了理论基础。

PEP-1-VP3融合蛋白的分离纯化与初步鉴定

目的构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体p ET15b-PEP-1中,构建重组表达质粒p ET15b-PEP-1-VP3,经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达PEP-1-VP3融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲和层析,进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果成功构建PEP-1-VP3融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了17.6k D的PEP-1-VP3融合蛋白。结论所构建的PEP-1-VP3融合蛋白为体内抗肿瘤研究提供了理论基础。

PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化

目的构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,并进行PEP1SOD1融合蛋白表达和纯化。方法以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA。经酶切后,分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coliBL21(DE3),表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,并进行鉴定。结果SDSPAGE和Westernblot分析表明,分别在相对分子质量22000和26000处出现SOD1和PEP1SOD1目标表达条带,目的蛋白占菌体总蛋白的30%,两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在。结论已成功地制备出SOD1和PEP1SOD1融合蛋白。

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合蛋白诱导小鼠免疫应答

目的研究细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31融合蛋白免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法 56只SPF级雌性Balb/c小鼠随机均分7组,分别为重组Bb-Eg95-EgA31皮下注射组(A组)、肌肉注射组(B组)、鼻腔内接种组(C组)、口服灌胃组(D组)、空载体对照组(E组)、Bb对照组(F组)和Bb培养用液体培养基(MRS)对照组(G组)。免疫后8周各组鼠用50个Eg原头节攻击,攻击25周后,处死小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE和脾细胞上清液IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平;MTT法测定脾细胞增殖反应;流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T细胞百分比和脾细胞凋亡发生率。结果重组Bb-Eg95-EgA31免疫组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平升高,IgG3和IgE降低;脾IFN-γ、IL-12和TNF-α水平升高,IL-10水平降低;脾T淋巴细胞明显增殖;脾CD4+和CD8+T细胞显著增加;脾细胞凋亡发生率显著降低。结论细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-E-gA31融合蛋白能诱导小鼠产生有效的保护性免疫应答。

猫干扰素ω3与胸腺肽α1融合蛋白表达及活性检测

依据猫IFN-ω3和THY-α1的分子结构特征及大肠杆菌密码子的偏爱性设计引物,同时在IFN-ω3和THY-α1中间设计了1个(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)×3总共15肽的linker。采用搭桥PCR方法获得二者的融合基因。将该基因克隆至pBVIL载体中,构建了pBVIL-IFNω3-THYα1原核表达载体。将重组载体转化至Rosseta(DE3)细胞中,经过IPTG诱导表达及蛋白质分离纯化,获得了质量浓度为0.78 g/L的IFNω3-THYα1融合蛋白。经E玫瑰花环形成试验和细胞病变抑制试验,结果表明E玫瑰花环形成率平均为23.4%,融合蛋白的活力值为7.4%,细胞病变抑制试验同阳性对照组结果基本一致,融合蛋白中的IFNω3、THYα1均较好地保持各自的生物活性,为IFNω3-THYα1融合蛋白进一步的开发和应用奠定了基础。

EV71与CB3病毒VP1融合蛋白的构建表达与抗原性初步评价

目的构建pET-22b-ECVP1表达载体,在大肠杆菌中诱导表达肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇B3型(CB3)病毒VP1融合蛋白(ECVP1),并鉴定其抗原性。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分别从EV71与CB3病毒基因组中扩增得到外壳蛋白VP1基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法拼接构建重组融合蛋白基因(ecvp1),将该片段连接到pET-22b表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白,经Western blot鉴定其抗原性。结果pET-22b-ECVP1表达载体构建成功,融合蛋白相对分子量约为65 ku,Western blot分析表明,该融合蛋白能被抗EV71及抗CB3抗体特异识别。结论成功构建pET-22b-ECVP1表达质粒并诱导ECVP1融合蛋白表达,且融合蛋白具有良好的抗原性。

融合蛋白Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)介导的T细胞对B细胞淋巴瘤细胞杀伤作用观察

目的观察融合蛋白Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)介导的T细胞对人B细胞淋巴瘤细胞Raji的杀伤作用。方法采用常规酶切、连接等分子克隆方法构建慢病毒表达载体pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19/4-1BBL),将其瞬时转染至293T细胞,收集培养上清并纯化融合蛋白Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)。采用流式细胞术分析Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)与CD19^(+)细胞(Raji细胞)、CD3^(+)细胞(人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat)、4-1BB^(+)细胞(Jurkat细胞)的结合活性。收集Raji细胞,按照效靶比20∶1加入T细胞,分别加入0.08、0.8、8 pmol/mL的Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)、Tandab(CD3/CD19)、4-1BBL,采用LDH释放实验测算T细胞对Raji细胞的杀伤效率,采用ELISA法检测8 pmol/mL融合蛋白作用后细胞培养液上清中的IL-2、采用流式细胞术检测CD3^(+)CD69^(+)细胞、CD3^(+)CD25^(+)细胞比例。结果pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)构建成功,表达的融合蛋白Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)可与CD19^(+)、CD3^(+)、4-1BB^(+)细胞结合。Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)组、Tandab(CD3/CD19)组T细胞对Raji细胞杀伤百分比均高于4-1BBL组(P均<0.01)。在效靶比一定时,随着融合蛋白Tandab浓度增高,T细胞对Raji细胞的杀伤百分比逐渐增高(P均<0.01)。Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)组、Tandab(CD3/CD19)组、4-1BBL组细胞培养液上清中的IL-2水平均高于PBS组(P均<0.05)。Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)组、Tandab(CD3/CD19)组CD3^(+)CD69^(+)细胞、CD3^(+)CD25^(+)细胞比例高于4-1BBL组、PBS组(P均<0.01)。结论融合蛋白Tandab(CD3/CD19/4-1BBL)可有效介导T细胞对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用。

EGFP-CIDE-3及D sRed1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位

目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位。方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a(+)-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed1、CIDE-3克隆入真核表达载体pShuttle-CMV中。酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染入293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系。结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3构建成功。荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系。结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系。

转抗虫融合基因(cry1Ac3-cpti)玉米(Zea mays L.)植株的获得及其抗虫性分析

将苏云金杆菌家族中的Cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因,构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体,表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白.用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中,轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选,获得可育的再生植株.经PCR及Southern blot分子检测,证实所获得的再生植株为转基因植株.抗虫性分析结果表明,部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性.

PEP－1－SODl融合蛋白的制备、表达及纯化

目的：构建原核表达载体pQE30－PEP－1－SOD1，并进行PEP－1－SOD1融合蛋白表达和纯化。方法载体质粒pQE－30及模板质粒pUC57－PEP－1－SOD1分别进行酶切后，构建原核表达载体pQE30－PEP－1－SOD1载体。经测序证实构建成功后，转化JM109，表达PEP－1－SOD1融合蛋白，并进行鉴定。结果 SDS－PAGE电泳分析表明，位于相对分子质量约25×10^3处出现PEP－1－SOD1的目标表达条带；目的蛋白以天然的可溶性的形式存在。结论已成功制备出PEP－1－SOD1融合蛋白。

miR-27b-3p调控OPA1表达对心力衰竭模型心肌细胞线粒体融合的影响

目的探讨miR-27b-3p通过调控视神经萎缩蛋白1(OPA1)表达对心力衰竭模型心肌细胞线粒体融合的影响。方法SD大鼠随机分成Sham组、model组、antagomir NC组和miR-27b-3p antagomir组,每组15只。结扎左冠状动脉前降支制备心力衰竭大鼠模型,造模成功的大鼠于尾静脉分别注射antagomir NC或miR-27b-3p antagomir。4周后,qRT-PCR检测miR-27b-3p和OPA1 mRNA水平;透射电镜观察心肌组织线粒体结构变化。采用0.8%的戊巴比妥钠对分离的大鼠心肌细胞进行诱导,并随机分成model组、inhibitor NC组、miR-27b-3p inhibitor组、miR-27b-3p inhibitor+siRNA NC组和miR-27b-3p inhibitor+OPA1 siRNA组,另取正常细胞作为Control组。qRT-PCR检测miR-27b-3p和OPA1 mRNA水平;双荧光素酶实验检测miR-27b-3p和OPA1的靶向关系;荧光素酶发光法检测线粒体ATP合成活力;DCFH-DA荧光染料检测线粒体活性氧(ROS)水平;JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位(ΔΨm);Western blot检测OPA1、线粒体融合蛋白(MFN)1、MFN2、电压依赖性阴离子通道1(VDAC-1)、细胞色素C氧化酶Ⅳ(COXⅣ)、线粒体转录因子A(Tfam)、过氧化物酶体增殖物激活受体Y辅激活因子1(PGC-1α)、自噬标志蛋白Beclin-1、B淋巴细胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bnip3)表达。结果与Sham组比较,model组大鼠心肌组织中miR-27b-3p表达明显增加(P<0.05),OPA1 mRNA明显减少(P<0.05),且线粒体结构受损,数量明显减少;miR-27b-3p antagomir下调miR-27b-3p表达后,OPA1 mRNA表达明显增加(P<0.05),线粒体结构明显恢复,数量也显著增多。细胞实验发现,与Control组相比,model组miR-27b-3p表达上调,OPA1 mRNA及OPA1、MFN1、MFN2、VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白表达下调,Beclin-1、Bnip3蛋白表达上调,线粒体ROS上升,ATP和ΔΨm下降(P<0.05);而miR-27b-3p inhibitor下调miR-27b-3p表达后,上述各项指标水平均得以逆转。miR-27b-3p靶向负调控OPA1蛋白表达。在抑制miR-27b-3p表达的基础上沉默OPA1可使戊巴比妥钠诱导的心肌细胞OPA1、MFN1、MFN2、VDAC-1、COXIV、Tfam、PGC-1α蛋白表达明显降低,Beclin-1、Bnip3蛋白表达明显升高,线粒体ROS明显上升,ATP和ΔΨm明显下降(P<0.05)。结论miR-27b-3p在心力衰竭模型心肌组织中高表达,抑制miR-27b-3p通过靶向负调控OPA1蛋白表达促进心力衰竭模型心肌细胞线粒体融合。

PEP-1肽介导人Cu,ZnSOD转导入人脐静脉内皮细胞

目的:构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,观察表达的融合蛋白PEP1SOD1能否进入细胞.方法:以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA.经酶切后分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,分别转化大肠杆菌,表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,将鉴定和纯化后的融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞.结果:得到高纯度的、有活性的SOD1和PEP1SOD1融合蛋白.PEP1SOD1融合蛋白能高效地转导入体外培养的人脐静脉内皮细胞,并表现出剂量依赖性和时间依赖性的特点;一旦进入细胞,PEP1SOD1融合蛋白可以维持48h.结论:PEP1SOD1融合蛋白能高效地转导入体外培养的人脐静脉内皮细胞,为SOD1进入组织细胞内发挥治疗作用提供了实验基础.

pET15b-pep-1-p27mt的构建、表达及意义

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性的表达。PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。

清道夫受体在树突状细胞提呈口蹄疫病毒VP1-VP4抗原中的作用

为研究清道夫受体在树突状细胞提呈口蹄疫病毒VP-VP4融合蛋白中的作用,构建了pET一32a-VP1-VP4原核表达系统,以此获得VP1-VP4融合蛋白。制备骨髓源树突状细胞(BMDCs)和淋巴结T细胞,首先用清道夫受体抑制剂poly(I)处理.BMDCs,然后再将VPl-VP4.融合蛋白负载经poly(I)处理后的BMDCs,并与淋巴结T细胞共培养,收集不同时间点的共培养上清液,用ELISA检测其中IFN-γ含量。结果显示,经poly(I)处理的试验组在每个时间点产生的IFN-γ含量均明显高于对照组,且差异极显著(P<0.01)。表明清道夫受体可识别口蹄疫病毒VPl-VP4融合蛋白,并在BMDCs提呈VPl-VP4抗原的过程中发挥负调节作用。

谷胱甘肽-S-转移酶人趋化因子CCL3L1的表达

目的克隆人趋化因子CCL3L1基因,表达并初步纯化谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-CCL3L1融合蛋白。方法从乳腺癌细胞MCF7中提取总RNA,采用RT-PCR扩增CCL3L1cDNA基因,克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,重组载体经酶切和测序鉴定后,在BL21大肠杆菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-CCL3L1融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting分析表达产物。结果经测序、酶切鉴定证明CCL3L1基因已正确插入到pGEX-4T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为34000的新生GST-CCL3L1融合蛋白。结论GST-CCL3L1融合蛋白可被成功表达。

基因重组融合蛋白hNPY对小鼠前脂肪细胞增殖和分化影响的实验研究

目的：前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化潜力的特异化的前体细胞，如能找到可促进前脂肪细胞增殖和分化的因子或药物，并在脂肪组织移植的同时使用，则有希望提高脂肪组织的移植效果，本实验探索一种新的人体肥胖关联基因和外周脂肪细胞激动剂一基因重组融合蛋白hNPY对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响及其分子调控机制。方法：采用基因工程技术设计hNPY基因上下游序列，经过PCR反应合成hNPY的cDNA后与pET28a＋载体重组，再将已构建好、并经测序确认无误的重组质粒pET28a—NPY转导至大肠杆菌BL21（DE3），再由IPTG诱导表达hNPY融合蛋白、并进行纯化；然后，将体外培养的小鼠3T3-L1前脂肪细胞经由3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素和地塞米松进行联合诱导；诱导2d后，再将此细胞分为三组，即空白对照组（未加任何诱导剂组）、经典诱导组（胰岛素诱导）和实验干预组（hNPY融合蛋白干预），其中，实验干预组再按照hNPY融合蛋白浓度不同又分为高、中、低三个浓度组（10^-8mol／L、10^-19mol／L和10^-9 mol／L）。分别于细胞培养的第7d和第12d用相差显微镜观察各组细胞的形态学变化，再于细胞培养的第12d用油红O染色观察脂肪细胞的分化程度；同时，采用MTT法检测该细胞的增殖状况；采用Westernblot法检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物体增殖剂活化受体-γ（PPAR-γ）、CAAT／增强子结合蛋白-a（C／EBP-a）蛋白的表达水平。结果：低浓度（10^-10 mol／L）的hNPY融合蛋白，无明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的作用效果；中浓度（10^-9 mol／L）的hNPY融合蛋白，可有效促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖及细胞数量增多；而高浓度（10^-8 mol／L）的hNPY融合蛋白，不仅能明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的细胞增殖和分化，且能显著提高该细胞C／EBPa和PPARγ的表达水平、而明显降低INSIG-2的表达。结论：高浓度（10^-8mol／L）的基因重组融合蛋白hNPY能够明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化，其促进3T3-L1细胞增殖和分化的分子调控机制很可能与上调PPARγ、C／EBPa表达和降低INSIG-2表达水平有关，这提示：hNPY作为脂肪细胞膜上受体NPYR的有效促进剂或激动剂，未来很可能成为人体外周脂肪细胞一个新的作用靶点。

PEP-1介导的血红素氧合酶HO-1对缺血再灌注损伤大鼠肝脏TNF-α mRNA表达的影响

目的:探讨PEP-1介导的血红素氧合酶-1(HO-1)对缺血再灌注损伤(IR I)大鼠肝脏肿瘤坏死因子(TNF-α)mRNA的影响。方法:SD大鼠经尾静脉注射HO-1(HO-1组)或PEP-1-HO-1(PEP-1-HO-1组)300μg后,制备大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,1、6、12、24 h后用RT-PCR法检测肝组织中TNF-αmRNA水平,另设对照。结果:PEP-1-HO-1组肝脏TNF-αmRNA水平均较单纯IR I组和HO-1组低(P<0.05),且随IR I时间延长而逐渐降低(P<0.05)。结论:PEP-1介导的HO-1融合蛋白降低肝脏TNF-αmRNA表达,可能减轻肝缺血再灌注损伤程度。

腰椎融合术后手术部位感染外周血NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的表达水平

目的分析腰椎融合术后手术部位感染(SSI)外周血核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1/白细胞介素-1β(NLRP3/Caspase-1/IL-1β)信号通路的表达。方法选取2016年6月-2021年6月河南中医药大学第二附属医院收治的行腰椎融合治疗患者术后发生SSI患者76例为研究组,同期未感染患者80例为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫印迹法检测外周血单个核细胞(PBMCs)中NLRP3炎性小体组分NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和Caspase-1 mRNA及蛋白相对表达,检测血清IL-1β、IL-18、IL-33、C-反应蛋白(CRP)及降钙素原(PCT)水平。结果研究组PBMCs中NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA及蛋白表达均高于对照组(P<0.05);研究组患者血清IL-1β、IL-18、IL-33、CRP和PCT水平均高于对照组(P<0.05);Pearson相关性分析显示,腰椎融合治疗术后感染患者NLRP3 mRNA及蛋白表达分别与CRP、PCT呈正相关(P<0.05),IL-1β、IL-18和IL-33分别与CRP呈正相关(P<0.05)。结论NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路可能参与腰椎融合治疗患者术后SSI的发生发展。

急性肾缺血再灌注损伤模型小鼠线粒体去乙酰化酶3的表达

背景:对比剂肾病已经成为医院获得性急性肾损伤的主要原因之一,其本质是肾脏的急性缺血再灌注损伤,其中去乙酰化酶3在其中发挥的作用还不清楚。目的:探索不同肾脏缺血时间对去乙酰化酶3表达的影响及其与线粒体损伤相关指标的关系。方法:构建C57BL/6J小鼠急性肾脏缺血模型,给予不同的缺血时间(15,20,25,30 min),再灌注48 h。根据缺血时间,分为对照组、假手术组、缺血15,20,25,30 min再灌注组,每组8只。术后48 h,检测血清肌酐、尿素氮水平,TUNEL试剂盒检测肾组织细胞凋亡情况,荧光素酶发光法检测肾组织ATP水平,苏木精-伊红染色观察肾组织病理变化,透射电镜下观察线粒体变化,Western blot检测去乙酰化酶3和线粒体动力相关蛋白1、线粒体融合蛋白1的表达。结果与结论:①血清肌酐、尿素氮、组织病理评分及凋亡指数在各缺血组中逐渐升高;②肾组织线粒体结构损伤在各缺血组中逐渐加重,ATP含量总体下降;③正常对照组与假手术组及缺血15min再灌注组的去乙酰化酶3蛋白水平无差异;与缺血15min再灌注组比较,缺血20 min再灌注组的去乙酰化酶3蛋白水平升高(P<0.05),缺血25 min继续升高(P<0.05),缺血30 min表达最高(P<0.05);④与假手术组比较,线粒体融合蛋白1在缺血15-20 min升高(P<0.05);与缺血15 min再灌注组比较,线粒体融合蛋白1在缺血25 min和30 min进一步升高(P<0.05);⑤缺血15 min再灌注组的线粒体动力相关蛋白1水平达高峰,与缺血15 min再灌注组比较,缺血20 min再灌注组的线粒体动力相关蛋白1水平有所下降(P<0.05),缺血25 min再灌注组进一步下降(P<0.05);⑥相关性研究发现,ATP与去乙酰化酶3存在显著负相关(r=-0.77,P<0.05),去乙酰化酶3与线粒体动力相关蛋白1存在负向相关性(r=-0.52,P<0.05),去乙酰化酶3与线粒体融合蛋白1存在正向相关性(r=0.72,P<0.05);⑦结果表明,肾脏缺血再灌注损伤时,ATP水平下降会刺激肾组织线粒体去乙酰化酶3表达呈现时间依赖性增高,进而促进线粒体融合,抑制线粒体裂解,起到保护线粒体、维持能量代谢的作用,提示去乙酰化酶3可能是减轻肾脏缺血再灌注损伤的干预靶点。

HIV-1 SF2株env基因C1与C3区的嵌合表达

①目的 构建HIV 1SF2株env基因C1与C3区嵌合片段的克隆并在大肠杆菌中表达。②方法用DNAstar软件辅助设计引物 ,以含有HIV 1SF2株前病毒基因组的 9B1R6质粒为模板 ,PCR法分别扩增出env基因C1和C3段 ;两个片段经KpnⅠ酶切、T4连接酶连接和扩增后 ,再将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的嵌合片段插入表达载体 pGEX 4T 2中 ,构建重组表达质粒 pGEX 4T 2 /C1C3;重组质粒经酶切、测序鉴定后 ,以TSS法转入大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白和SDS PAGE电泳分析表达蛋白图谱。③结果 经酶切和测序分析 ,插入片段大小、方向和读码框架正确 ,无碱基错配 ,表明成功构建 pGEX 4T 2 /C1C3克隆 ;重组克隆在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导 ,高效表达出相对分子质量为 4 .3万的融合蛋白。④结论 重组质粒 pGEX 4T 2 /C1C3的构建和表达成功 ,为进一步研究该表达蛋白的活性和HIV疫苗的研制奠定了基础。