棉花PEPC基因种子特异性ihpRNA表达载体的构建及鉴定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到PEPC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子(1123bp)、α球蛋白B基因启动子(1149bp)连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。

甘蓝型油菜PEPC基因保守序列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建

为了通过转基因途径获得油菜种子中PEPC基因发生转录后基因沉默,通过PCR扩增分别分离得到了甘蓝型油菜种子特异性表达的Napin启动子序列(1138bp)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因保守序列(181bp),将它们分别克隆到pMD18-T载体中,利用中间载体pBS-NEI构建了PEPC基因的反向重复框。再将PEPC基因片段以正向的方式连接到一个可剪切的内含子5'末端,以反向的方式连接到该内含子的3'末端;然后将Napin启动子序列克隆到植物表达载体pCAMBIA1391的pUC18多克隆位点上,获得了种子特异表达的载体pCAMNapin;再将PEPase基因的反向重复序列克隆到pCAMNapin载体Napin启动子的3'末端,构建了具有种子特异性表达的PEPC基因的ihpRNA表达载体pCAMNapin-B2-NEI-B1。通过限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。