溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表达及其乙酰化、琥珀酰化修饰的鉴定

构建溶藻弧菌HY9901 PEPCK蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并鉴定该蛋白的乙酰化及琥珀酰化修饰。采用PCR克隆pepck基因,构建pET-28a-pepck并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株的培养温度、IPTG浓度及时间进行优化,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化、琥珀酰化修饰。结果显示,pepck基因全长1 629 bp,重组菌株可以正确表达分子质量约60.9 kD的蛋白。诱导温度:在28℃条件下PEPCK存在于上清和包涵体中,在37℃则主要以包涵体形式存在;IPTG浓度:0.2 mmol/L-1.0 mmol/L范围内,PEPCK的表达量无明显差异;时间:在0-8 h内PEPCK表达量随时间增长逐渐增加,诱导8 h后趋于稳定。Western blot显示PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。成功构建溶藻弧菌PEPCK重组表达菌株,其最优诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG,28℃诱导8 h;经鉴定PEPCK蛋白具有乙酰化修饰和琥珀酰化修饰。