寡肽转运蛋白PEPT1靶点的口服药物设计研究进展

寡肽转运蛋白PEPT1在寡肽及拟肽类药物肠转运中发挥重要的作用,其能介导二肽或三肽类的吸收。PEPT1对底物识别的多专属性,使得以PEPT1为靶点设计载体前药提高药物吸收成为一种非常具有前景的策略。本文综述了有关肽转运蛋白PEPT1的生物学结构,及以PEPT1为靶点的前药最新研究进展,以期为后续对PEPT1的研究提供思路和参考。

肉鸡肠道PepT1 mRNA表达的肠段差异性与发育性变化

选用遗传背景相同的1日龄父母代雄性Arbor Acre（AA）鸡和父母代雄性岭南黄肉雏鸡各120羽,采用相对定量RT-PCR方法,以30 d时岭南黄鸡肠道样品为模板,研究肉鸡肠道寡肽转运载体1（Peptide transporter 1,PepT1）mRNA表达的肠段差异性;以AA肉鸡和岭南黄鸡十二指肠和空肠样品为模板,研究不同品种肉鸡肠道PepT1 mRNA表达的发育性变化.结果显示：（1）岭南黄肉鸡肠道PepT1 mRNA的表达丰度从十二指肠、空肠、回肠到结直肠依次降低,其中十二指肠显著高于结直肠（P＜0.05）;（2）AA鸡和岭南黄肉鸡PepT1 mRNA在十二指肠及空肠中的表达具有相同的发育模式,16 d表达丰度最高,16～44 d逐渐下降,58 d略微回升;不同基因型之间PepT1 mRNA丰度比较,AA鸡和岭南黄肉鸡两品种间PepT1 mRNA的表达没有显著差异（P＞0.05）.以上结果说明：（1）随着肠道空间位置的后移,岭南黄肉鸡肠道PepT1 mRNA的表达丰度逐渐降低,其中十二指肠的表达丰度显著高于结直肠（P＜0.05）;（2）不同品种肉鸡十二指肠及空肠PepT1 mRNA的表达具有相同的发育模式,且同日龄两品种间的表达丰度未见明显差异,表明PepT1 mRNA表达受到发育阶段的调控,但品种间具有稳定性.

爱拔益加肉仔鸡肠道PepT1、B^0AT和EAAT3 mRNA的表达差异与发育规律

本试验旨在研究爱拔益加(AA)肉仔鸡肠道小肽转运载体1(PepT1)、B0系统中性氨基酸转运载体(B0AT)、兴奋性氨基酸转运载体3(EAAT3)mRNA的表达差异与发育规律。试验选取1日龄雄性AA肉仔鸡120只,随机分为8个组,于1、7、14、21、28、35、42日龄,每个组选取1只肉仔鸡,采用实时荧光定量PCR技术检测不同肠段PepT1、B0AT、EAAT3 mRNA的相对表达量。结果显示:1)肉仔鸡不同肠段PepT1、B0AT、EAAT3 mRNA的相对表达量差异显著(P<0.05)。其中,PepT1 mRNA的相对表达量在十二指肠最高,空肠次之,回肠最低,B0AT、EAAT3 mRNA的相对表达量在回肠最高,空肠次之,十二指肠最低。2)肉仔鸡不同日龄PepT1、B0AT、EAAT3 mRNA的相对表达量存在极差异显著(P<0.01);在不同肠段上,PepT1、B0AT、EAAT3 mRNA的相对表达量随日龄的变化均表现为前期升高,后期平稳的趋势。由此可见,肉仔鸡肠道参与小肽及氨基酸吸收的转运载体PepT1、B0AT、EAAT3 mRNA表达具有肠段及日龄的差异性。

草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征

采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。

PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线的建立

为研究PepT1 mRNA在鸡小肠的表达对于蛋白质消化吸收的影响,实验建立了PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线。根据GenBank中PepT1的序列信息设计合成两对引物,引物一是克隆引物,用于从鸡小肠细胞中扩增出cDNA片段;引物二是荧光定量PCR引物,其长度包含于引物一中,用荧光定量PCR来检测基因的表达。通过克隆出PepT1基因282 bp部分片段并插入到PMD18载体中,从而构建出绝对荧光定量PCR标准曲线。从实验结果得出标准曲线的回归方程为Y=-3.205X+34.170,其回归系数R2=0.990,溶解曲线表现为单一的峰,通过对结果的具体分析,认为该方法可靠,特异性均较强,可成功构建目的基因的标准曲线。

小肽转运载体(PepT1)及其活性的调控

近来发现蛋白质的消化产物在动物肠道内有相当一部分是以小肽的形式吸收和利用。克隆和分析两个结构相似的小肽转运载体 (Pep T1和 Pep T2 )揭示了哺乳动物和禽类的小肽转运机制。这些小肽转运载体识别二肽和三肽 ,其活性受日粮蛋白质水平和各种激素的调控。目前对人、猪、鸡、大鼠、小鼠、兔子、绵羊等的 Pep T1的基因结构和蛋白质结构已有了系统的认识。就其生理特性、分布。

温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠PepT1和NHEs mRNA表达差异及发育性变化

为研究温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠寡肽转运载体PepT1(Solute carrier family 15 member 1)以及Na+/H+交换载体NHE2(Solute carrier family 9 member 2)和NHE3(Solute carrier family 9 member 3)mRNA的表达规律,选取产蛋日龄相近的温氏土鸡和白洛克鸡所产种蛋各96枚,每个品种随机分为6组,每组16枚,在相同的条件下进行孵化。分别在9,12,14,17,19胚龄(E)和出壳当天(DOH),每个品种选取16枚鸡胚,采集小肠样品,采用Real-time RT-PCR方法检测小肠PepT1、NHE2和NHE3 mRNA的相对表达丰度。结果显示:从发育性变化来看,PepT1、NHE2和NHE3mRNA在温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠的表达丰度都表现为随着胚龄的增加而上调,19胚龄后上调幅度较大;双因素方差分析表明,PepT1、NHE2和NHE3 mRNA的表达丰度在2个品种间无显著差异,但受发育阶段影响,PepT1 mRNA的表达丰度存在"品种×胚龄"的互作效应(P<0.000 1),NHE2和NHE3 mRNA表达丰度无"品种×胚龄"的互作效应(P>0.05)。说明PepT1、NHE2和NHE3 mRNA表达丰度在温氏土鸡和白洛克鸡胚小肠中具有相同的发育模式,其表达量受发育水平的影响,但品种间差异不显著。

鲤肠道小肽转运载体PepT1多克隆抗体的制备及其组织表达分析

为从蛋白水平研究小肽转运载体（PepT1）在鲤（Cyprinus carpio L.）不同组织中的表达及分布规律,本研究采用PCR法获得PepT1 cDNA片段,并转化至大肠杆菌Rosetta,对目标多肽进行原核表达,将Pep T1重组蛋白纯化后免疫新西兰长耳兔（Oryctolagus cuniculus）,获取兔抗鲤PepT1多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,免疫组化检测PepT1的组织表达情况,并用荧光实时定量PCR技术检测PepT1转录水平组织表达情况。结果显示,目标多肽分子量约为28 kD;抗体效价达到4×10~5。PepT1在鲤的前肠、中肠、后肠、脾、肝胰脏和肾中均有表达。肠道组织PepT1的高表达与其主要完成食物中肽的吸收功能密切相关,且吸收部位主要集中在前肠和中肠;肾中PepT1免疫染色阳性区域也较为明显,这与肾小管基底膜存在对短肽的重吸收功能相关。此外,肝胰脏和脾PepT1也有一定量的表达,可能与这两个重要器官代谢旺盛有关。本研究制备的兔抗鲤PepT1多克隆抗体能够有效识别鲤各组织中的PepT1蛋白,在后续研究中亦可用于其他鱼类PepT1转运蛋白的表达定位和定量研究。

脓毒症大鼠小肠上皮PepT1的表达变化及其与Ghrelin的相关性研究

目的探讨脓毒症对大鼠小肠上皮短肽载体1(PepT1)表达的影响以及PepT1表达与Ghrelin水平的关系。方法雄性SD大鼠48只,随机分为对照组(n=8)和脓毒症组(n=40)。脓毒症组大鼠采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症模型,模型建立后4、8、12、16、20h分别处死8只小鼠,留取小肠黏膜和全血标本。光镜下观察空肠黏膜的病理学变化,ELISA方法检测血清及肠黏膜Ghrelin水平,Real-time PCR及Western Blotting分别检测肠上皮PepT1 mRNA及蛋白的表达。结果 CLP所致脓毒症导致大鼠小肠黏膜明显损伤,主要表现为黏膜短缩、脱落,毛细血管扩张出血和溃疡形成。脓毒症8、12、16、20h各亚组小肠上皮PepT1 mRNA表达水平均较对照组明显下降(P<0.05),但各亚组间表达水平无明显差异(P>0.05);脓毒症12、16、20h亚组小肠上皮PepT1蛋白表达较对照组及脓毒症4h和8h亚组减少(P<0.05);血清和肠黏膜Ghrelin水平均在建模4h时达高峰,之后逐渐下降,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);血清和肠黏膜Ghrelin水平与PepT1蛋白表达均呈正相关(r=0.792、r=0.756,P<0.001)。结论脓毒症时Ghrelin表达水平在短暂上升后显著下降,与小肠上皮PepT1蛋白表达密切相关,可能是导致脓毒症时小肠上皮PepT1表达下降的原因之一。

饲粮粗蛋白质水平对肉仔鸡肠道PepT1和b^(o,+) AT mRNA表达的影响

【目的】研究饲粮粗蛋白质水平对肉仔鸡肠道PepT1和b^(o,+)AT mRNA表达的影响.【方法】选用240只21d‘科宝’肉公鸡,随机分为3组,分别饲喂粗蛋白质水平为16%(16%CP组),18%(18%CP组)和20%(20%CP组)的3种饲粮,每组设8个重复,每个重复10只鸡,42d测定肠道PepT1和b^(o,+)AT mRNA含量.【结果】16%CP组平均日增质量、氮利用率和代谢能值均显著低于其他2组(P<0.05),而料肉比显著高于其他2组(P<0.05).PepT1mRNA表达以空肠最高,十二指肠次之,回肠最低,且空肠显著高于十二指肠和回肠(P<0.05);b^(o,+)AT mRNA表达以回肠最高,十二指肠次之,空肠最低,而回肠显著高于十二指肠和空肠(P<0.05),十二指肠显著高于空肠(P<0.05).随着饲粮粗蛋白质水平的增加,饲粮干物质消化率、粗蛋白质消化率和消化能值均有提高,但未达到显著性水平(P>0.05).肉仔鸡小肠各肠段PepT1mRNA和b^(o,+)AT mRNA的表达均随饲粮粗蛋白质水平的提高而有不同程度的改善,16%CP组PepT1mRNA在十二指肠和空肠的表达显著低于20%CP组(P<0.05),其在空肠的表达显著低于18%CP组(P<0.05).20%CP组b^(o,+)AT mRNA在十二指肠和空肠的表达显著高于16%CP组(P<0.05).【结论】适宜的饲料粗蛋白质水平有利于PepT1和b^(o,+)AT mRNA的表达.

小肽转运载体(PepT1和PepT2)研究进展

由小肽转运载体介导的小肽吸收对动物的生长和发育有着特殊的作用,因此,对小肽转运载体的深入研究在生理、药理和临床上都有着非常重要的意义。文中主要从小肽转运载体(PepT1和PepT2)的蛋白质分子结构与功能、主要的组织分布和影响其活性的因素三方面进行简要综述。

Nod2-Rip2信号通路在短肽载体PepT1介导的细菌产物引发小肠黏膜炎性损伤中的作用

目的:探讨Nod2-Rip2-NF-κB信号通路在PepT1转运细菌产物酰基二肽(MDP)诱导小肠黏膜炎性损伤中的作用。方法:将80只大鼠随机分为正常组、实验对照组、MDP灌注组和PepT1竞争抑制组,每组20只。正常组大鼠不作处理,其余三组分别给予Krebs-Ringer缓冲液、加细菌产物MDP的缓冲液、加MDP和Gly-Gly的缓冲液灌注4 h。大鼠处死后采集小肠标本,检测小肠组织的病理变化和黏膜中Nod2和Rip2 mRNA表达、NF-κB活性和炎性因子,如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素8(IL-8)、髓过氧化物酶(MPO)水平。结果:小肠组织病理学表明,MDP可引起炎性细胞的聚集和肠黏膜损伤。大鼠小肠内灌注MDP后,其黏膜中Nod2与Rip2mRNA的表达、NF-κB的结合活性以及炎性物质MPO、IL-8、TNF-α的表达均较正常组和实验对照组明显升高。上述表现被营养性二肽Gly-Gly明显抑制。结论:Nod2-Rip2-NF-κB信号通路在PepT1转运细菌产物并激活肠道炎性反应中发挥着重要作用。

药物与肠道肽转运蛋白PEPT1的相互作用及影响因素

H+协同转运载体PEPT1主要存在于小肠上皮细胞的刷状缘膜上,肠道PEPT1对于消化道中蛋白质的降解产物二肽、三肽具有转运吸收的功能,另外肽类似药物如β-内酰胺类抗生素、血管紧张素转化酶抑制剂、非肽药物伐昔洛韦等也经此载体转运吸收。肠道PEPT1对于维持机体的内环境稳定以及药物的胃肠道吸收发挥重要作用。随着对PEPT1基因序列、蛋白结构、功能活性等方面研究的逐渐深入,对于调控PEPT1在膜上表达、影响其功能活性以及与底物亲和力的因素及相关的作用机制有了一定的了解,加之PEPT1广泛的底物专属性,使其成为新药开发中重要的药物传递的靶蛋白。了解药物与肠道肽转运蛋白PEPT1的相互作用及其影响因素,对于了解药物-药物相互作用,提高药物口服吸收的生物利用度,研究抗肿瘤药物的靶向治疗以及个体化给药等方面具有十分重要的意义。

小肽转运蛋白PepT1的研究进展

在过去的20年中,小肽的吸收与利用已成为动物营养与生物医药应用中的热门研究领域.其中小肽转运蛋白PepT1对小肽的转运具有重要作用.该文通过对PepT1的结构、分布以及调控因素等方面的描述,试图阐述小肽转运蛋白PepT1对动物营养和健康的作用,为动物营养学家配制小肽日粮配方提供理论依据,为进一步改善饲粮蛋白质的利用效率、节约蛋白质资源开辟新的途径.

α-菠菜甾醇对小鼠小肠段药物转运体P-gp和PEPT1表达的影响

以酒石酸泰乐菌素为底药,探讨α-菠菜甾醇对小鼠小肠段药物转运体P-gp和PEPT1表达的影响。48只小鼠分为4组:α-菠菜甾醇组,酒石酸泰乐菌素组,α-菠菜甾醇和酒石酸泰乐菌素混合组,生理盐水对照组。每组按0.2 m L·10 g^(-1)体质量的剂量每天灌胃一次,共灌胃5 d,分别在1,3,5 d后处死1批采样。采用免疫组化的方法测定1,3,5 d的小鼠肠道上P-gp和PEPT1的表达。试验结果表明,α-菠菜甾醇组和混合组相对于对照组外排性药物转运体P-gp表达减少,而摄取性药物转运体PEPT1表达增多;酒石酸泰乐菌素组的外排性药物转运体P-gp表达增多,摄取性药物转运体PEPT1表达减少;且都随着用药时间的延长差异增大。表明α-菠菜甾醇具有抑制药物转运体P-gp表达和促进药物转运体PEPT1表达的作用。

二肽PEPT1吸收方式通过b^(0,+)系统促进肠道氨基酸的吸收

小肽和游离氨基酸是日粮蛋白在小肠中主要的消化产物,目前尚不明确这两种物质间的转运干扰。本试验用Caco-2细胞来研究PEPT1转运的二肽吸收是否会改变游离酸性、中性氨基酸的吸收。L-[~3H]Arg转运到Caco-2细胞是非依赖Na+,而主要是受b^(0,+)转运系统的调节。10mmol/l二肽培养的细胞能将L-Arg流速提高到4倍。本试验首次证明,小肠细胞内游离氨基酸和小肽的吸收相互影响,并能改变氨基酸吸收的动力学。

严重烫伤大鼠小肠上皮细胞PepT1生物学功能的改变及生长激素的调控

目的 :探讨严重烫伤大鼠肠上皮细胞刷状缘二肽转运载体 (PepT1 )生物学功能变化及生长激素的调控作用 ,以明确严重创伤后肠上皮细胞蛋白质吸收的特点。 方法 :采用SD大鼠 30 %烫伤模型 ,生长激素 2U/(kg·d)皮下注射 ,第 0、1、3、5、7天断髓处死 ,取中段空肠制成外翻肠囊 ,置于二肽溶液 (1 0 μCi /ml)中 ,比较烫伤大鼠与对照组大鼠肠上皮细胞PepT1对二肽的转运、摄取功能的变化。 结果 :正常大鼠经重组人生长激素 (rhGH)处理后 ,PepT1的转运功能无明显变化 (P =0 .1 92 6 ) ,而摄取功能明显增强 (P =0 .0 2 5 3) ;严重烫伤并经rhGH处理后 ,大鼠PepT1的转运和摄取功能较单纯烫伤大鼠均明显增强 (P =0 .0 0 82和 0 .0 391 )。 结论 :严重烫伤可下调肠上皮细胞PepT1对二肽的转运和摄取功能 。

蛋鸡小肠肽转运载体PepT1表达差异性的评定

本试验旨在研究蛋鸡十二指肠、空肠、回肠小肽转运载体mRNA表达的差异性。选用相同背景的健康成年蛋鸡10只,从十二指肠、空肠、回肠组织提取RNA样品,采用相对定量RT-PCR,对蛋鸡小肠各段肽转运载体mRNA表达的差异性进行评定。结果表明,蛋鸡空肠PepT1 mRNA的表达水平显著高于十二指肠(P<0.05),与回肠比差异不显著(P>0.05),十二指肠PepT1 mRNA的表达水平与回肠之间无显著差异(P>0.05)。

小肽转运蛋白(PepT1)的活性调节

小肽是蛋白质在动物体内消化的主要产物,而位于小肠刷状缘膜上的小肽转运蛋白(PepT1)在小肽的吸收过程中发挥着重要作用,因此PepT1的活性直接影响小肽的吸收。文中主要介绍底物、营养不良、激素、昼夜节律和生长发育对PepT1的活性调节。

日粮中添加小肽对育肥牦牛生产性能和消化道PepT1 mRNA表达的影响

【目的】研究日粮中添加小肽对育肥牦牛生产性能、养分表观消化率、血液指标及消化道小肽转运载体1(PepT1)mRNA表达的影响,为小肽在牦牛日粮中的合理应用提供数据支持。【方法】选取36头体重((180.98±20.57)kg)相近,健康的麦洼公牦牛,按照随机区组试验设计分为4组,每组9个重复,每个重复1头牛。分别饲喂小肽添加水平为0、0.75%、1.50%、2.25%的全混合日粮。预饲期30 d,正试期80 d。试验开始和结束时记录体重,每日饲喂时记录每头牦牛的喂料量及剩料量。试验最后一周,连续3 d收集每头牦牛的饲料及粪便样品,进行常规营养分析;同时,每组选取5头牦牛采集颈静脉血并制备血清,测定血清生化及免疫指标。试验结束后,将每组采血的5头牦牛屠宰,立即取瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃及十二指肠、空肠、回肠组织,通过实时荧光定量PCR法测定各组织中PepT1 mRNA的表达量。【结果】(1)平均日增重(ADG)、干物质采食量(DMI)和料重比(F/G)随小肽添加水平的升高均呈二次曲线变化(P<0.05),以2.25%组牦牛的生产性能表现最优,其DMI和ADG均显著高于对照组和0.75%组(P<0.05),而F/G显著低于对照组和0.75%组(P<0.05)。(2)随小肽添加水平的升高,日粮有机物(OM)和粗蛋白(CP)的表观消化率呈二次曲线上升(P<0.05),中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的表观消化率线性升高(P<0.01),以2.25%组消化率最高;各处理组中钙、磷的表观消化率无显著差异(P>0.05)。(3)随小肽添加水平的升高,血清中谷丙转氨酶(ALT)含量线性降低(P<0.05),而尿素氮(UN)含量线性升高(P<0.05),总蛋白(TP)含量有线性升高的趋势(P<0.10),谷草转氨酶(AST)含量呈二次曲线降低(P<0.05),而碱性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)含量未产生显著变化(P>0.05);日粮中添加不同水平小肽对牦牛血清中IgG、IgA和IgM三种免疫球蛋白的含量均无显著影响(P>0.05)。(4)牦牛消化道中PepT1 mRNA表达量由高到低依次为空肠、回肠、十二指肠、网胃、瓣胃、瘤胃、皱胃,且空肠PepT1 mRNA的表达量显著高于其他消化道部位(P<0.05),而皱胃PepT1 mRNA的表达量显著低于空肠和回肠(P<0.05);回肠、十二指肠、瘤胃、网胃、瓣胃的PepT1 mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。随小肽添加水平的升高,瘤胃、网胃和空肠的PepT1 mRNA表达量均呈线性升高变化(P<0.05),但对瓣胃、皱胃、十二指肠和回肠的PepT1 mRNA表达量均无显著影响(P>0.05)。【结论】日粮中添加小肽能够提高育肥牦牛的生产性能和养分表观消化率,改善肝功能,促进小肽在消化道中的转运吸收。在本试验条件下,日粮小肽添加水平为2.25%时饲喂效果最佳。