葛根芩连汤对2型糖尿病db/db小鼠胰腺组织PERK/ATF4/CHOP信号通路的影响

目的观察葛根芩连汤对2型糖尿病(T2DM)小鼠胰腺内质网应激的影响,探讨其治疗T2DM的作用机制。方法75只SPF级雄性db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组和葛根芩连汤高、中、低剂量组,每组15只,15只db/m小鼠作为空白组,给药组分别予相应药物灌胃12周。检测小鼠体质量、空腹血糖(FBG)及糖化血红蛋白(HbA1c),HE染色观察胰腺组织病理变化,TUNEL染色检测胰岛细胞凋亡情况,Western blot检测胰腺组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达,实时荧光定量PCR检测胰腺组织PERK、ATF4、CHOP mRNA表达。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著增加(P<0.01);胰腺组织结构不完整,边界模糊,内有空泡,胰岛细胞凋亡明显增加(P<0.01);胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著升高(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著减少(P<0.05,P<0.01);胰腺组织病理改变有所减轻,胰岛细胞凋亡不同程度减少(P<0.05,P<0.01);葛根芩连汤高、中剂量组和二甲双胍组胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著降低(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论葛根芩连汤可能通过抑制内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路,下调相关基因和蛋白表达,减少胰岛细胞凋亡,保护胰岛细胞功能,延缓T2DM进展。

FABP4沉默通过调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路对妊娠糖尿病大鼠内质网应激和胰岛素抵抗的影响

目的:探讨脂肪酸结合蛋白4(FABP4)沉默通过调节蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核细胞启动因子2α(eIF2α)/转录因子4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路对妊娠糖尿病(GDM)大鼠内质网应激(ERS)和胰岛素抵抗(IR)的影响。方法:腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立GDM大鼠模型。通过尾静脉注射FABP4 siRNA质粒(si-FABP4)、阴性对照质粒(NC)和PERK激活剂(CCT020312),将大鼠随机分为Normal组、GDM组、GDM+NC组、GDM+si-FABP4组、GDM+si-FABP4+CCT020312组。检测胰腺组织中FABP4含量、血脂水平、炎症标志物水平和氧化应激标志物水平,检测胰腺组织中PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。HTR-8/SVneo细胞分为5组:对照(Control)组、高糖(HG)组、HG+NC组、HG+si-FABP4组、HG+si-FABP4+CCT020312组,24 h后检测细胞中FABP4及PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。结果:与Normal组相比,GDM组大鼠血清和胰腺组织中FABP4水平显著上调(P<0.05)。FABP4沉默显著降低了FBG和IR,并伴有血脂、CRP、TNF-α、IL-6及MDA水平降低和SOD、CAT水平升高(P<0.05)。此外,FABP4沉默减轻了胰腺和胎盘组织损伤。而CCT020312上调PERK、eIF2α磷酸化水平和ATF4、CHOP蛋白表达后,FABP4沉默对GDM大鼠IR、炎症、氧化应激以及胰腺和胎盘损伤的抑制作用均被逆转(P<0.05)。FABP4在HG诱导的HTR-8/SVneo细胞中上调表达,沉默FABP4可抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路蛋白表达,CCT020312则逆转这种变化(P<0.05)。结论:FABP4沉默通过抑制炎症和氧化应激,改善GDM大鼠的IR和ERS,其机制与抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路有关。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨化浊解毒消痈方对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜的保护作用

目的基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨化浊解毒消痈方对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的作用。方法将48只小鼠随机分成正常组、模型组、美沙拉嗪组(阳性药,045 g/kg)和化浊解毒消痈方高、中、低剂量组(2868、1434、717 g/kg),每组8只。除正常组外,其余各组小鼠均采用25%葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用7 d建立溃疡性结肠炎模型,造模后各组灌胃给予相应剂量药物。给药7 d后,分析小鼠疾病活动指数(DAI)评分,HE染色观察结肠组织病理学改变,RT-qPCR和Western blot法检测结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA和蛋白表达。结果与模型组比较,化浊解毒消痈方各剂量组和美沙拉嗪组小鼠DAI评分降低(P<005),结肠组织病理形态得到改善,结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA和蛋白表达降低(P<005),其中高剂量组作用与美沙拉嗪组相当。结论化浊解毒消痈方能抑制结肠上皮细胞的过度凋亡,对UC小鼠结肠损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路活化、抑制凋亡,进而修复结肠黏膜、促进溃疡愈合有关。

远隔缺血预适应对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带区PERK/p-eIF2α通路及自噬的影响

目的研究远隔缺血预适应(remote ischemic preconditioning, RIPC)对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区自噬相关蛋白Beclin1、LC3B以及内质网分子伴侣GRP78、内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)相关通路PERK/p-eIF2α的影响,探讨RIPC保护脑缺血损伤作用的相关机制。方法将24只健康雄性Sprague-Dawley大鼠采用抽签法随机分为3组:假手术(Sham)组、大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)组和RIPC+MCAO组。每组8只大鼠。采用改良线栓法制备大鼠MCAO再灌注模型,于缺血90 min后拔出线栓再灌注24 h。其中RIPC+MCAO组在MCAO之前,给予大鼠连续3 d的RIPC(采用夹闭双侧股动脉10 min开放10 min,每天3个循环的方法)。免疫荧光双标染色法检测再灌注大鼠缺血半暗带区自噬相关蛋白Beclin1、LC3B以及GRP78、p-eIF2α的表达。结果 1)Sham组大鼠脑内偶见Beclin1阳性细胞。MCAO组大鼠再灌注24 h缺血半暗带区Beclin1表达水平比Sham组显著升高(P<0.05)。给予RIPC的脑缺血再灌注大鼠半暗带区Beclin1的表达水平比MCAO组显著减少(P<0.05)。Beclin1与神经元标志物NeuN共定位。2)MCAO组大鼠再灌注24 h,脑缺血半暗带区GRP78分别与Beclin1和LC3B免疫荧光染色共定位。3)MCAO组大鼠再灌注24 h,脑缺血半暗带区Beclin1与p-eIF2α免疫荧光染色共定位。Sham组大鼠未见Beclin1和p-eIF2α双标阳性细胞,MCAO组大鼠再灌注24 h半暗带区可见大量Beclin1和p-eIF2α双标阳性细胞。给予RIPC后,缺血大鼠半暗带区Beclin1和p-eIF2α双标阳性细胞数目比MCAO组明显减少(P<0.05)。结论 RIPC可能通过抑制ERS相关通路PERK/p-eIF2α,减少神经元中自噬相关蛋白产生,避免神经元过度激活自噬,发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

基于内质网应激PERK/eIF2α信号通路探讨温针灸足三里联合香砂六君子汤治疗脾胃气虚型功能性消化不良的作用

目的:通过观察温针灸足三里联合香砂六君子汤对大鼠PERK/eIF2α信号通路的影响,探讨温针灸足三里联合香砂六君子汤对脾胃气虚型功能性消化不良的治疗作用。方法:选取SPF级SD大鼠60只,建立功能性消化不良大鼠模型;经验证模型后,随机分为正常组、模型组、西药组、中药组、温针灸组、联合组,每组10只。分别进行相应的干预后,测量大鼠的体重、胃排空率;HE染色观察胃窦组织病理形态变化;免疫组化检测胃窦组织PERK、p-eIF2α表达情况;Western blot检测胃窦组织PERK、p-eIF2α、elF2α蛋白相对表达量。结果:在实验第14天、实验第28天,与正常组相比,模型组的体重均较小,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,西药组、中药组、温针灸组和联合组的体重均较大,差异有统计学意义(P<0.05);与中药组、温针灸组相比,西药组、联合组的体重均较大,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组相比,模型组的胃排空率较低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,西药组、中药组、温针灸组和联合组的胃排空率均较高,差异有统计学意义(P<0.05);与西药组、中药组、温针灸组相比,联合组的胃排空率较高,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较,模型组大鼠胃窦组织的PERK、p-eIF2α着色显著降低;与模型组相比,西药组、中药组、温针灸组、联合组均表现为PERK、p-eIF2α着色显著增多。与正常组比较,模型组大鼠胃窦组织的PERK、p-eIF2α蛋白表达显著降低,eIF2α蛋白表达升高;与模型组相比,西药组、中药组、温针灸组、联合组均表现为PERK、p-eIF2α蛋白表达显著升高,eIF2α蛋白表达降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:温针灸足三里+香砂六君子汤可以有效治疗脾胃气虚型功能性消化不良可能与其调节内质网应激PERK-eIF2α-ATF4信号通路的作用有关。

基于PERK/Nrf2通路探讨复方芪鹰颗粒治疗糖尿病周围神经病变的机制

目的基于PERK/Nrf2通路探讨复方芪鹰颗粒对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠的作用机制。方法将72只体重180~220 g、8周龄的SPF级雄性Wistar大鼠采用随机数字表法分为正常对照组、模型组、阳性药组及复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组,每组12只。除正常对照组外,其余五组均持续喂食高脂饲料,8周后注射链脲佐菌素(30 mg/kg),然后选取空腹血糖>11.1 mol/L的大鼠继续高脂饮食4周构建DPN模型。DPN造模成功后,复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组分别给予复方芪鹰颗粒1.17、2.34、4.68 g/kg,阳性药组给予氧化三甲胺(110 mg/kg),灌胃2 ml/次,1次/d,正常对照组、模型组给予等量双蒸水。干预4周,比较六组干预前后的血糖变化,对六组坐骨神经进行苏木精-伊红染色,采用蛋白质印迹法检测六组坐骨神经中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、转录激活因子4(ATF4)、核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)表达水平。结果正常对照组有髓神经纤维结构完整、分布均匀、排列规则,轴索、髓鞘及神经膜形态结构良好、完整,神经内膜形态结构正常;模型组有髓神经纤维脱失、减少,部分排列紊乱,部分轴索变性,节段性脱髓鞘,神经膜增厚,神经内膜胶原纤维增生;复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组髓神经纤维轴索变性、脱髓鞘、神经膜增厚及神经内膜增生程度轻于模型组。DPN造模成功后,模型组血糖高于正常对照组(P<0.05),复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组血糖与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。药物干预4周后,模型组血糖高于正常对照组,复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组血糖低于模型组,复方芪鹰颗粒中、高剂量组血糖低于复方芪鹰颗粒低剂量组(P<0.05)。模型组坐骨神经组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP、caspase-3高于正常对照组,Nrf2低于正常对照组(P<0.05)。复方芪鹰颗粒中、高剂量组GRP78、ATF4、CHOP低于模型组,Nrf2高于模型组;复方芪鹰颗粒高剂量组p-PERK、caspase-3低于模型组(P<0.05)。复方芪鹰颗粒高剂量组ATF4、CHOP低于复方芪鹰颗粒低剂量组,复方芪鹰颗粒中剂量组CHOP低于复方芪鹰颗粒低剂量组(P<0.05)。结论复方芪鹰颗粒具有一定的降血糖和保护神经的作用,其作用机制可能是通过抑制PERK/Nrf2通路,减轻了内质网应激。

基于内质网应激PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨枳葛口服液含药血清对乙醇诱导BRL-3A损伤的保护作用及机制研究

目的基于内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)信号通路PERK/eIF2α/ATF4/CHOP探讨枳葛口服液含药血清对BRL-3A大鼠肝细胞损伤的保护作用及机制。方法(1)制备含药血清:SD雄性大鼠随机分为3组:枳葛口服液组、美他多辛组、正常组,分别予以枳葛口服液、美他多辛及生理盐水灌胃,连续干预5天,腹主动脉取血制备含药血清。(2)培养正常BRL-3A大鼠肝细胞,用不同浓度乙醇(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%)干预细胞24 h后用CCK-8法测定各组细胞存活率。(3)BRL-3A大鼠肝细胞分为正常组,模型组,美他多辛组,枳葛口服液低、中、高剂量组(后简称为低剂量组、中剂量组、高剂量组)。24 h后测定各组细胞上清液中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)水平,CCK-8检测BRL-3A细胞存活率,Real-time PCR及Western blot检测各组细胞内PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路相关mRNA及蛋白表达水平。结果(1)不同浓度乙醇(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%)干预细胞24 h后,细胞存活率随着乙醇浓度的升高呈逐渐下降趋势,当乙醇浓度为5%时,细胞存活率明显下降(P<0.05),故选择乙醇浓度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5.0%、3.0%、5.0%进行后续实验。(2)与正常组相比,模型组上清液中GGT、LDH含量显著升高(P<0.05),PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路相关因子mRNA和蛋白的表达显著升高(P<0.05),呈现明显肝损伤状态。(3)与模型组相比,枳葛口服液组及美他多辛组以上指标均呈现不同程度的降低,其中枳葛口服高剂量组效果最显著(P<0.05)。结论枳葛口服液含药血清能够改善乙醇诱导的BRL-3A大鼠肝细胞损伤,其机制可能与抑制内质网应激PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路有关。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨银杏内酯B治疗代谢性脂肪性肝病的作用

目的:通过动物实验验证银杏内酯B(GB)治疗代谢性脂肪性肝病(MAFLD)的作用是否与调控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路,抑制内质网应激,减少肝细胞凋亡及炎症反应相关。方法:72只雄性SD大鼠随机分为正常组,模型组,辛伐他汀组,GB低、中、高剂量(GB-L、GB-M、GB-H)组(n=12),高脂高糖饲料喂养12周构建MAFLD模型(正常组除外)。治疗8周后,收集血清和肝组织。生化试剂盒检测血脂和肝脂[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]及肝功能[天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)];酶联免疫吸附法(ELISA)法检测血清和肝脏中的炎性因子[白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平;HE染色、油红O染色观察肝组织病理学;Western blot法检测肝脏组织中GRP78、PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果:肝脏组织病理学显示,与正常组相比,模型组大鼠肝脏脂肪变性显著,与模型组相比,各治疗组脂肪变性情况有明显改善;生化指标和蛋白表达显示,与正常组相比,模型组大鼠肝脏及血清TC、TG、LDL-C、IL-1、IL-6、TNF-α,血清AST、ALT及肝脏GRP78、PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bax水平显著升高(P<0.05),血清、肝脏HDL-C及肝脏Bcl-2水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,各治疗组大鼠血清和肝脏TC、TG、LDL-C、IL-1、IL-6、TNF-α,血清ALT、AST及肝脏GRP78、PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bax水平显著降低(P<0.05),肝脏Bcl-2水平显著升高(P<0.05),与模型组相比,GB-H组大鼠血清和肝脏HDL-C水平明显升高(P<0.05),GB-L组和GB-M组HDL-C水平呈上调趋势,但这2组相较于模型组,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:GB对MAFLD具有治疗作用,其作用机制可能与调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路抑制内质网应激,缓解肝细胞凋亡及炎症反应有关。

呋塞米对脑出血模型大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及继发性脑损伤的影响

目的探讨呋塞米(FUR)对脑出血(ICH)大鼠RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)/真核起始因子2α(eIF2α)/转录因子CCAAT增强子结合蛋白的同源蛋白(CHOP)通路及继发性脑损伤的影响。方法将大鼠分为假手术组、模型组(脑定位注射Ⅳ型胶原酶,建立ICH模型)、FUR低剂量组(FUR-L)、FUR中剂量组(FUR-M)、FUR高剂量组(FUR-H)、神经节苷脂组,每组18只。药物处理后,检测神经功能,对其进行Longa评分;测量大脑含水量;用Evans蓝外渗实验检测血脑屏障损伤;用HE染色检测海马神经元损伤;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)水平;用免疫印迹法检测大鼠脑组织PERK/eIF2α/CHOP通路相关蛋白p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达。结果相比假手术组,模型组大鼠海马神经元变性坏死,皱缩变小,数目明显减少,呈现严重病理损伤,Longa评分、Evans蓝渗出量、大脑含水量、血清IFN-γ及IL-6水平、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平明显升高(P<0.05)。相比模型组,FUR-L、FUR-M、FUR-H组及神经节苷脂组大鼠海马神经元形态有不同程度恢复,病理损伤减轻,Longa评分、大脑含水量、Evans蓝渗出量、血清IFN-γ及IL-6水平、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平均降低(P<0.05)。结论FUR可下调PERK/eIF2α/CHOP通路蛋白表达,缓解脑水肿及海马神经元损伤,修复ICH模型大鼠神经功能。

尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I通过PERK/eIF2α通路诱导Tca8113细胞凋亡的机制研究

目的:探讨内质网应激(ERS)相关的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核翻译起始因子2α(eIF2α)通路在尖吻蝮蛇毒抑瘤组分I(AAVC-I)诱导人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡中的作用及机制。方法:不同实验浓度(4. 0、8. 0和16. 0 mg/L)的AAVC-I处理Tca8113细胞24 h后采用苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态;流式细胞术(annexin V-FITC/PI双荧光染色法)检测细胞凋亡;Western blot检测ERS相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78),PERK/eIF2α通路中的磷酸化PERK(p-PERK)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)及下游的活化转录因子4(ATF4)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP),以及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果:AAVCI各浓度组分别与正常对照组相比以及各浓度组之间相互比较的结果显示,随着AAVC-I浓度的增加,Tca8113细胞活力逐渐降低,细胞逐渐皱缩变小,间隙增大,胞核浓缩、碎裂,出现凋亡小体,细胞凋亡率增高(P<0. 05);GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP及Bax蛋白水平上调,Bcl-2表达下调(P<0. 05)。结论:AAVC-I抑制Tca8113细胞活力的同时引发细胞发生ERS并诱导细胞凋亡,其诱导细胞凋亡的机制与PERK/eIF2α通路密切相关。

抑制PERK/eIF2α通路对七氟醚诱发POCD大鼠内质网应激和α-突触核蛋白的影响

目的探究抑制PERK/eIF2α通路对七氟醚诱发术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)大鼠内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)和α-突触核蛋白(α-Syn)的影响。方法24只SD大鼠随机分为对照组、七氟醚组和GSK2606414组(n=8)。七氟醚组和GSK2606414组参考文献通过七氟醚建立SD大鼠POCD模型。GSK2606414组大鼠用GSK2606414灌胃,剂量为150 mg/kg。Western blot检测PERK/eIF2α通路水平,水迷宫实验和跳台实验检测神经功能和学习能力,TUNEL染色检测凋亡,Western blot检测ERS和α-Syn。结果与对照组比较,七氟醚组的PERK/eIF2α通路被激活,神经功能和学习能力降低,海马体的细胞凋亡率、α-Syn和ERS标志蛋白CHOP、Caspase-3水平显著升高(P<0.05)。GSK2606414组PERK/eIF2α通路水平显著低于七氟醚组,大鼠神经功能和学习能力高于七氟醚组,海马体的细胞凋亡率、α-Syn、CHOP、Caspase-3水平显著低于七氟醚组(P<0.05)。结论七氟醚会引起PERK/eIF2α通路、ERS和α-Syn的上调,而抑制PERK/eIF2α通路会显著抑制ERS和α-Syn的表达,缓解海马体神经元的凋亡。

黄芪多糖对Tg诱导PERK/eIF2α通路介导HT29细胞凋亡的保护机制研究

目的探讨黄芪多糖对毒胡萝卜素内酯(Tg)诱导PERK/eIF2α通路介导HT29细胞凋亡的保护作用。方法将细胞分为空白组、模型组、黄芪多糖低剂量组、黄芪多糖高剂量组。除空白组外,其余组给予1μmol/L Tg诱导24 h后进行PERK及p-eIF2α蛋白表达的检测。结果用Tg诱导HT29细胞,PERK及p-eIF2α水平随时间延长呈依赖性增加(P<0.05)。与空白组比较,模型组CHOP表达明显增加(P<0.05);与模型组比较,黄芪多糖低、高剂量组CHOP表达均减少(P<0.05)。与空白组比较,模型组PERK、p-eIF2α蛋白质表达明显增加(P<0.01),通过不同剂量黄芪多糖干预后,PERK、p-eIF2α蛋白质表达呈下降趋势(P<0.05)。Tg诱导HT29细胞后明显增加Caspase-3的凋亡(P<0.01),给予不同剂量黄芪多糖干预后HT29细胞Caspase-3的凋亡率较模型组下降(P<0.05或P<0.01),且高剂量黄芪多糖明显优于低剂量组(P<0.05)。结论毒胡萝卜素内酯诱导HT29细胞凋亡可能与激活内质网应激PERK/p-eIF2α信号通路密切相关,黄芪多糖具有干预该信号通路作用,能抑制HT29细胞凋亡。

ERK1/2信号通路在角质细胞生长因子-2诱导角膜基质细胞增殖中的作用

目的观察角质细胞生长因子(keratinocyte growthfactor-2,KGF-2)对角膜基质细胞的增殖作用及ERK1/2信号在角膜基质细胞增殖中的调控作用,探讨KGF-2对角膜基质细胞增殖的可能机制。方法体外培养角膜基质细胞,MTT法检测细胞增殖,Western blot检测磷酸化ERK1/2表达水平。结果 KGF-2在1～100 mg·L-1对角膜基质细胞有明显的促进增殖作用且呈现剂量-效应关系;100 mg·L-1 KGF-2处理角膜基质细胞,5、15、30 min后ERK1/2磷酸化表达水平明显升高,60、90、120、180 min后ERK1/2磷酸化表达水平逐渐减弱;20μmol.L-1 ERK1/2抑制剂PD98059可抑制KGF-2对角膜基质细胞的促增殖作用。结论 KGF-2激活ERK1/2信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059阻断;ERK1/2信号通路调控角膜基质细胞的增殖,在角膜基质细胞损伤中发挥作用。

独活寄生汤干预膝骨关节炎模型大鼠软骨PERK/Bip信号通路的表达

背景:前期研究表明独活寄生汤可有效抑制软骨细胞凋亡,但其具体机制尚不明确。目的:观察独活寄生汤对膝骨关节炎大鼠软骨PERK/Bip信号通路关键调节因子PERK、Bip、eI F-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3的影响,探讨独活寄生汤防治骨关节炎的作用机制。方法:80只SD大鼠适应性喂养1周后,随机分为正常组(20只)和造模组(60只)。造模组应用膝关节注射木瓜蛋白酶法制备膝骨关节炎模型。造模成功后随机分为3组,即模型组(n=20)、治疗组(n=20)和阳性对照组(n=20)。正常组和模型组给予生理盐水;治疗组给予独活寄生汤,按照9.3 g/(kg·d)的药量进行灌胃;阳性对照组给予盐酸氨基葡萄糖胶囊0.15 g/(kg·d)。2周为1个疗程,共4个疗程。分别于2,4个疗程后切取右侧胫骨平台,免疫组化法和RT-PCR法检测PERK、Bip、e IF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3蛋白和mRNA表达情况。结果与结论:(1)RT-PCR结果显示,独活寄生汤和盐酸氨基葡萄糖均能抑制PERK、Bip、e IF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表达(P<0.05或0.01),干预时间越长,效果越明显,但2组间无显著差异(P>0.05);(2)免疫组化结果与RT-PCR结果趋势一致,即独活寄生汤和盐酸氨基葡萄糖均能抑制PERK、Bip、e IF-2α、ATF-4、GADD153、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达(P<0.05或0.01),干预时间越长,效果越明显,但2组间无显著性差异(P>0.05);(3)结果提示,独活寄生汤可能是通过调控PERK/Bip信号通路,进而抑制因内质网应激反应引起的软骨细胞凋亡。

基于内质网应激PERK-eIF2α-CHOP通路探讨健脾消渴方对小鼠胰岛min6细胞的保护作用

目的探讨健脾消渴方对高糖诱导min6细胞内质网应激(ERS)信号通路蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-真核启动因子(eIF)2α-C/EBP同源蛋白(CHOP)和细胞凋亡的影响。方法将min6细胞随机分为正常对照组(Con组,5.5 mmol/L葡萄糖)、模型组(Model组,25.0 mmol/L葡萄糖)、健脾消渴方组(Jpxk组,25.0 mmol/L葡萄糖+最佳干预浓度的健脾消渴方)和阳性对照药利拉鲁肽组(Li组,25.0 mmol/L葡萄糖+最佳干预浓度的利拉鲁肽),用CCK8法检测细胞活力,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胰岛素分泌;Hoechst33258染色和膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)/碘化丙啶(PI)双染法流式检测细胞凋亡;Western印迹检测PERK、eIF2α、活化转运酶(ATF)4、CHOP、葡萄糖调节蛋白(GRP)78、胱天蛋白酶(Caspase)12蛋白表达水平;实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达。结果与Con组相比,Model组min6细胞活力显著减弱,胰岛素水平明显降低,细胞凋亡率明显升高(P<0.01),且凋亡小体增多,染色质和细胞核固缩;明显上调PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA及蛋白表达、GRP78、Caspase12蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。与Model组相比,Jpxk组min6细胞活力明显提高,胰岛素水平明显升高,凋亡细胞比例明显降低(P<0.05,P<0.01),min6细胞内凋亡小体减少;且明显下调PERK、eIF2α、CHOP蛋白及mRNA、GRP78、Caspase12蛋白及ATF4 mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。与Li组相比,健脾消渴方能显著降低PERK及CHOP蛋白表达(P<0.05)。结论健脾消渴方可能通过抑制PERK、eIF2α、CHOP活性,改善内质网应激以保护min6细胞,PERK-eIF2α-CHOP信号通路可能是健脾消渴方发挥作用的主要机制之一。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨四味黄芪散对高原低氧致脑损伤大鼠的保护作用及机制

目的基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨四味黄芪散(藏黄芪、藏红花、川芎、沉香)对高原低氧致脑损伤大鼠的保护作用及机制。方法将SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药物组(诺迪康,0.125 g·kg^(-1)·d-1)以及四味黄芪散低、中、高剂量组(3.255、6.510、13.020 g·kg^(-1)·d-1),每组10只。四味黄芪散各剂量组灌胃给药,每日1次,连续14 d;阳性药物组给予诺迪康灌胃给药,每日1次,连续给药7 d。采用实验动物低压模拟舱复制高原低氧致脑损伤大鼠模型,低氧暴露持续7 d。采用HE染色法观察大鼠脑组织病理变化;TUNEL染色法检测大鼠脑组织细胞凋亡情况;TBA法、微板法分别检测脑组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的水平;Western Blot法检测大鼠脑组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平;RT-qPCR法检测大鼠脑组织中PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠海马CA1区锥体细胞水肿,排列不规则,胞质疏松淡染;海马CA1区红色荧光强度显著增强(P<0.01);脑组织中MDA含量显著升高(P<0.01),GSH活性显著降低(P<0.01);脑组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著升高(P<0.01),PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,阳性药物组及四味黄芪散高、中、低剂量组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紧密,边界较清,细胞水肿得到改善;海马CA1区的红色荧光强度明显减弱(P<0.05);脑组织中MDA含量显著降低(P<0.01),GSH活性显著升高(P<0.05,P<0.01)。四味黄芪散高、中剂量组大鼠脑组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达显著下调(P<0.05,P<0.01);四味黄芪散低剂量组大鼠脑组织中p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),eIF2α、CHOP mRNA表达显著下调(P<0.05,P<0.01)。结论四味黄芪散能改善高原低氧致脑损伤大鼠的脑组织神经元细胞水肿,增强抗氧化应激能力,减少脑组织细胞凋亡,可能与其调控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路抑制内质网应激有关。

PERK／p-eIF2a通路在氟致机体损伤中的作用

氟中毒可造成机体的骨相和非骨相组织损害，其发生机制不清。大量研究证明，氟能引起机体各系统或脏器的蛋白合成下降、细胞凋亡增加，从而造成机体组织的广泛损伤，并且损伤机制可能与内质网应激有关。蛋白激酶受体样内质网激酶／磷酸化真核翻译起始因子2α（PERK／p-eIF2a）通路为内质网应激最先活化的通路，可能在氟中毒的发生机制中有重要作用。因此，作者将对PERK／p-eIF2a路在氟致机体损伤中的作用进行综述，以期为氟中毒发病机制的阐明和防治提供新思路。

基于PERK/Nrf2/HO-1信号通路研究瑞马唑仑对心肌缺血再灌注损伤大鼠铁死亡的影响

目的:基于蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路探究瑞马唑仑对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠铁死亡的影响。方法:将90只SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、MIRI组、低剂量-瑞马唑仑组(L-瑞马唑仑组,5 mg/kg)、高剂量-瑞马唑仑组(H-瑞马唑仑组,20 mg/kg)、H-瑞马唑仑+PERK抑制剂组(瑞马唑仑20 mg/kg+GSK2606414 1 mg/kg),每组18只。采用结扎冠状动脉左前降支(LAD)0.5 h、再灌注2 h制备MIRI大鼠模型,于再灌注2 h后即刻尾静脉注射给药,再灌注24 h后进行组织取材。酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清心肌损伤标志物[肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)]水平;HE染色观察心肌组织病理改变;Tunel染色检测心肌细胞凋亡;透射电镜观察心肌细胞超微结构变化;检测心肌组织中铁死亡相关标志物[铁、活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)]水平;蛋白质印迹法(Western Blot)检测心肌组织中PERK/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达。结果:与Sham组相比,MIRI组心肌结构受损,纤维排列紊乱,线粒体呈现显著的铁死亡特征(膜固缩,膜密度增加,嵴减少),血清中CK-MB、cTnI水平,心肌细胞凋亡率及心肌组织中铁、ROS、MDA水平升高(P<0.05),心肌组织中GSH水平及p-PERK/PERK、核Nrf2/Nrf2、HO-1蛋白表达降低(P<0.05);与MIRI组相比,L-瑞马唑仑组和H-瑞马唑仑组心肌组织上述病理改变明显减轻,血清CK-MB、cTnI水平,心肌细胞凋亡率及心肌组织中铁、ROS、MDA水平降低(P<0.05),心肌组织中GSH水平及p-PERK/PERK、核Nrf2/Nrf2、HO-1蛋白表达升高(P<0.05);与H-瑞马唑仑组相比,H-瑞马唑仑+PERK抑制剂组心肌组织上述病理改变加重,血清CK-MB、cTnI水平,心肌细胞凋亡率及心肌组织中铁、ROS、MDA水平升高(P<0.05),心肌组织中GSH水平及p-PERK/PERK、核Nrf2/Nrf2、HO-1蛋白表达降低(P<0.05)。结论:瑞马唑仑可通过抑制铁死亡减轻大鼠MIRI,可能通过激活PERK/Nrf2/HO-1信号通路而实现。

4-苯基丁酸抑制PERK/eIF2α信号通路缓解大鼠脊髓损伤内质网氧化应激反应

目的探讨4-苯基丁酸对脊髓损伤大鼠的作用和可能机制。方法采用Allen’s法操作方法建立脊髓损伤模型,将SD大鼠分为假手术组(Sham组)、模型组(SCI组)和4-苯基丁酸钠治疗组(4-PBA组);对三组大鼠进行脊髓运动功能(BBB)的评分;应用HE染色检测各组大鼠脊髓的损伤情况;采用ELISA检测各组大鼠血清中MDA、CAT、SOD、GSH-Px等蛋白的表达情况;应用免疫组织化学检测内质网应激蛋白GRP78、ATF4和CHOP的表达水平;Western blot法检测PERK、eIF2α、ATF4蛋白的表达水平。结果 4-苯基丁酸明显降低中性粒细胞的浸润程度,减少脊髓内GRP78、ATF4和CHOP表达水平,BBB评分在各个时间点明显升高,上调血清SOD、CAT,GSH-Pxe和IF2α的表达水平,下调MDA和ATF4的表达水平(P<0.05),p-PERK/PERK的表达无明显变化。结论 4-苯基丁酸缓解线粒体氧化应激从而减轻大鼠脊髓损伤与抑制PERK/eIF2α信号通路相关。