异种肝肾联合移植中猪内源性逆转录病毒的检测

目的检测猪内源性逆转录病毒(PERV)基因在异种肝肾联合移植供受体中的表达,以期为PERV的跨物种传播提供参考依据。方法以6基因编辑猪恒河猴肝肾联合移植的组织样本作为研究对象,采用RT-PCR和PCR技术检测移植前后供受体不同组织中PERV编码基因、PERV各亚型以及猪线粒体细胞色素B基因的表达情况。结果供体猪的不同组织中存在PERV编码基因gag和pol、PERV-A和PERV-B亚型以及猪线粒体细胞色素B基因,但不存在PERV-C亚型。移植终点时受体不同组织中均未检出PERV基因序列。结论基因编辑猪恒河猴异种肝肾联合移植受体存活的14 d内没有发生PERV的跨物种传播。

猪内源性反转录病毒5′端非编码区的克隆及结构分析

通过五指山猪内源性反转录病毒5′端非编码区(5′UTR)cDNA的克隆,分析其一级结构和调控元件,为进一步研究其在PERV复制、转录中的调控机制奠定基础。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长约1035bp的PERV 5′UTR。通过NCBI公共数据库BLASTn序列进行同源性分析,并应用KEGG数据库对该转录调控区进行顺式作用元件定位分析,结果发现PERV 5′UTR与GenBank公布的部分PERV 5′UTR相比较,同源性在82.6~94.8%之间。一级结构分析发现PERV 5′UTR由U3、R、U5区、引物结合区(PBS)及前导序列组成,可能的核心启动子序列与具有增强子作用的39bp重复序列分别位于U3区的-67^+1与-97^-59区段。在5′UTR转录调控区(-428^+507)鉴定出31个有效的顺式作用元件位点,其中NF-Y、TBP、Oct-1、HSF、GATA-1和GATA-2等与PERV的转录、调控密切相关。

异种移植中猪内源性逆转录病毒的传播

器官移植是治疗各类终末期疾病最有效的手段,为了解决器官移植中供体短缺的问题,人们开始探究异种移植的可能。猪是异种器官移植常见的供体来源之一,猪器官作为连接两个物种间的桥梁,其携带的病毒有可能在物种间传播并存在引起人畜共患病的风险。猪内源性逆转录病毒(PERV)整合在基因组中,是一种跨物种传播的逆转录病毒。本文介绍了PERV传播特性的影响因素、PERV及其重组病毒的传播风险以及异种移植试验中PERV的检测与传播风险评估,以期为缓解器官移植供体严重短缺的现状,推动异种移植技术的发展提供参考。

猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型的建立

目的 建立猪内源性反转录病毒感染HEK2 93细胞的模型 ,验证PERV在体外对人源细胞的感染性 ,并进一步研究PERV的生物学特性。方法 将G4 18抗性的HEK2 93细胞与猪源PK 15细胞共培养 ,6周后 ,用含有6 0 0 μg mlG4 18的选择性培养基对共培养细胞进行加压筛选 ,用以除去共培养体系中的PK 15细胞 ;然后应用PCR及RT PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。结果 经 6周共培养及 3周加压筛选后 ,细胞的形态、生长速度及折光性均未见明显变化 ;PCR及RT PCR鉴定表明 ,筛选后的共培养体系中已没有PK 15细胞的存在 ;PERV特异性检测方法检测显示 ,该细胞模型的DNA中已有PERV的整合且有PERV特异性mRNA的表达。结论 本实验成功建立了PERV感染HEK2 93细胞的模型 ,证实了PERV在体外对人源细胞具有感染性 ;

聚合酶链反应检测4种猪源细胞系中的内源性反转录病毒(英文)

为了建立检测猪内源性反转录病毒 (porcine endogenous retrovirus,PERV)的特异性方法 ,根据已发表的 PERV的序列 ,设计并合成了针对 PERV核心蛋白 (gag)、多聚酶 (pol)、囊膜蛋白 (env)基因的 3对引物 ,预期扩增片段分别为 36 1、15 0、2 6 5 bp。应用 PCR技术检测了 PERV在 4株猪源细胞中的整合情况。结果表明 ,在所有被检细胞的基因组中均存在有 PERV的前病毒序列 ;应用 RT- PCR检测上述 4株猪源细胞中 PERV特异性 m RNA的表达 ,结果均为阳性。试验还对建立的上述 2种方法的特异性进行了探讨 ,结果表明试验建立的 PERV检测法具有较高的特异性。该方法的建立为进一步研究 PERV奠定了基础 ,还可对异种移植动物模型及异种移植受体进行病原安全性监测。

中国巴马小型猪封闭群内源性反转录病毒存在状况分析

检测分析猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus;PERV)在中国巴马小型猪封闭群中的携带情况。根据本实验室已建立的PCR、RT_PCR检测方法,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)及囊膜基因(env)的存在与表达进行检测;同时根据目前通用的env基因分型方法检测PERVenv_Ae、nv_Be、nv_C的存在与表达情况。所有被检样品不仅存在PERV gag、pol、env特异性DNA,而且都能够转录为RNA;所有样品同时存在PERV A、B亚型的前病毒,且有70%个体还同时存在PERV_C亚型前病毒,但仅有90%样品检测到PERV_A亚型的表达,50%检测到PERV_B亚型的表达,而所有的样品均未检测到PERV_C型的表达。巴马小型猪封闭群外周血淋巴细胞基因组中存在PERV_A、B、C 3种亚型,但仅有A、B两种亚型能够表达。PERV_A、B、C 3种亚型的同时存在,预示着巴马小型猪封闭群中存在不同亚型病毒重组的可能性。

中国特有小型猪内源性反转录病毒囊膜基因的克隆及进化分析

目的 克隆分析中国特有小型猪来源的猪内源性反转录病毒（PERV）囊膜基因（env）。比较不同来源毒株的异同及系统进化关系。方法 应用RT-PCR的方法分别从中国实验小型猪、巴马香猪及五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增PERV env基因，克隆入T载体后测序；随后以PCR方法对克隆PERV env基因进行分型检测；最后采用DNAsis及DNAstar软件对克隆的env基因和国外毒株env基因进行同源性及系统进化进行分析比较。结果 本试验所克隆的3株PERV env基因长度分别为1983bp、1986bp及1968bp，分别编码661、662和656个氨基酸，分型检测均为PERV-A亚型。同源性分析表明：国内这3个分离株env基因与国外来源于不同宿主的PERV-A、B、C亚型env基因的同源性分别在92．8～96．5％、69．4～73．4％及77．5％～80．8％之间。结论 PERV中国株的进化与A、B、C亚型分类有关，与宿主、分布地域关系不大，且PERV—A亚型与C亚型的亲源关系更近于B亚型。

中国小型猪内源性反转录病毒研究进展与对策

作者介绍了国内外猪内源性反转录病毒(PERV)研究进展,简述了中国不同品种小型猪PERV存在情况、PERV前病毒全基因克隆与序列分析、细胞水平鉴定方法、感染HEK293细胞研究平台的创建、猪A3F对PERV的抑制作用研究,以及从分子遗传学上揭示不同品系PERV特异性等创新性研究成果,分析了五指山小型猪近交系具有PERV基因拷贝少且没有PERV-C等特异性,以及展望培育中国PERV阴性猪新品系方法等研究,以期为人类异种器官移植和生物医用材料产品安全性研发,解决小型猪PERV疾病传播危险性提供科学对策和新的方向。

猪内源性反转录病毒5′非编码区启动子活性的分析

【目的】构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5′非编码区(5′UTR)为启动子的萤光素酶表达载体,分析5′UTR的转录调控规律。【方法】将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达。【结果】缺失R区的5′UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5′UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。【结论】在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性。在5′UTR的下游序列中,包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强,同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5′UTR的转录活性。

猪内源性反转录病毒在中国实验小型猪中的存在与表达

目的 对中国实验小型猪中内源性反转录病毒的存在与mRNA的表达进行检测 ,摸清中国实验小型猪中内源性反转录病毒的携带情况。方法 根据已发表的PERV的序列设计并合成了三对引物 ,分别用于检测PERV核心蛋白基因 (gag)、多聚酶基因 (pol)及囊膜基因 (env)的存在与表达 ;同时 ,根据目前通用的env基因分型方法合成了三对用于分型检测的引物env A、env B、env C。应用PCR、RT PCR扩增的方法 ,对来自于中国实验小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行了检测。结果 在 6个被检DNA样品中均检出了PERV特异性DNA的存在 ;同样 ,在被检RNA样品中均有PERV特异性RNA的表达 ,且所表达的PERV均为A型和B型 ,在所有样品中均未检出C型PERV的表达。结论 初步表明中国实验小型猪中存在内源性反转录病毒序列 ,且能以mRNA的形式表达 ,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。

广西巴马小型猪内源性反转录病毒进化年代分析

【目的】确定广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV-BM)的进化年代。【方法】对先前扩增、测序获得的9个PERV-BM的LTRs,一个PERV-BM全长基因组序列,登录号为HM159246及Gen Bank上发表的所有背景清楚的猪内源性反转录病毒(PERV)的LTRs及env序列进行分析。首先利用DAMBE软件对上述序列比对分析,合并同源性较高的,筛选有差异代表性的核酸序列的数据集。然后利用MEGA5.2软件Neighbor-Joining方法计算PERV-BM遗传进化关系。利用DAMBE软件对上述筛选的序列集进行替换饱和度计算,分析核酸进化速率的稳定性;利用MEGA5.2软件,通过最大相似法对筛选数据制作的遗传进化树进行分子钟行为分析。最后对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析,对符合分子钟行为的LTRs序列,以假设的恒定进化速率计算PERV-BM的进化年代。【结果】经过DAMBE软件分析后,选出80多个Gen Bank上发表的有代表性的env、LTRs序列数据集。对PERV-BM(HM159246)序列全长遗传进化分析显示,PERV-BM与中国的PERV核酸序列EF133960和GU980187,荷兰的AF356697亲缘关系较近,与韩国的HQ540595和美国的AF038600和NC_003059亲缘关系则较远。利用DAMBE软件对筛选数据集替换饱和度检测结果显示,S和V值随PERV序列之间进化分歧的增加呈线性的增加。LTRs序列数据集替换饱和曲线呈线性关系,没有替换饱和现象发生,LTRs的进化随时间持续且稳定。数据集env序列替换饱和曲线不完全呈线性关系,表明env序列集进化速率不稳定。利用MEGA5.2的最大相似法对LTRs和env数据集的进化树进行分子钟行为检测结果显示,LTRs序列集接受分子钟假说,env进化不符合分子钟行为,这和不饱和度检测的结果一致。因此可用LTRs进化的近分子钟行为进行PERV进化年代的计算。利用DAMBE软件对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析结果显示,3′-LTR的进化符合分子钟行为可用于进化年代计算。假设以灵长类ERV的积累突变率,每个核苷酸每年的替换率2.3×10-9—5.0×10-9,计算PERV-BM约进化于3.3×106—7.1×106年前。【结论】PERV-BM进化年代与欧洲小型猪PERV进化时间7.6×106年前相近。

广西巴马小型猪内源性反转录B亚型病毒5′非编码区的序列扩增及分析

应用SMART RACE方法快速扩增广西巴马小型猪内源性反转录病毒（PERV）5′非编码区,获得了一条长度为1 423 bp的PERV-5′UTR序列（GenBank登录号GU390231）,该序列与GenBank已发表的PERV-A、B、C各亚型同源性分别为92.4%~95.2%、91.8%~99.5%和86.5%~92.6%,遗传进化树分析,扩增序列为B亚型PERV-5′UTR。一级结构分析表明,该序列由U3、R、U5、PBS和LEADER 5个区域构成,与GenBank已发表的其他序列相比缺少344 bp。通过plantCARE数据库鉴定,GU390231序列得到28个有效的顺式作用元件,推测这些元件对PERV的转录起着或正或负的调控作用。本试验获得的PERV-B亚型5′UTR序列对进一步研究广西巴马小型猪PERV-B亚型病毒的转录调控机制奠定了基础。

巴马小型猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型的建立

首先将巴马小型猪(BM)、巴马香猪(BMXZ)外周血淋巴细胞分别与G418抗性HEK293细胞(G418R293)共培养,通过G418加压筛选,除去共培养体系中巴马小型猪、巴马香猪外周血淋巴细胞,然后应用PCR及RT-PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。结果经6周共培养及3周加压筛选后,细胞的形态、生长速度及折光性均未见明显变化;PCR及RT-PCR鉴定表明,筛选后的共培养体系中已没有巴马小型猪、巴马香猪外周血淋巴细胞的存在;PERV特异性检测方法检测显示,该细胞模型的DNA中已有PERV的整合且有PERV特异性mRNA的表达。从而证实了猪外周血淋巴细胞来源的PERV在体外也能够感染人源细胞系,为研究PERV的生物学特性及病原安全性的评价搭建了技术平台。

海南地方猪内源性反转录病毒的检测分析

为了解猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV)在海南地方猪种五指山猪和海南猪基因组中的存在状况。试验利用猪内源性反转录病毒特异性引物对这两种猪的基因组进行PCR检测。结果显示:PERV普遍存在于海南地方猪基因组中,其中在五指山猪中PERV-A、PERV-B、PERV-C存在率分别是100%、100%、20.69%;在海南猪中PERV-A、PERV-B、PERV-C存在率分别是100%、100%、25.49%。该研究为海南地方猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。

用RACE技术快速扩增五指山猪来源的猪内源性反转录病毒3'LTR

测定我国小型猪来源的猪内源性反转录病毒(PERV)3'LTR,以便于PERV全基因的克隆和分析。用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从五指山猪外周血淋巴细胞mRNA中扩增到PERV-3'LTR,并克隆入pGEM-Teasy载体,将阳性克隆进行序列测定和同源性分析。测序结果显示该克隆3'端的尾部有一个由12个A组成的poly(A)信号;其R区与PERV-MSL的R区(约64bp)基本一致,同源性分析表明其与PERV-MSL的3'LTR具有81%的序列同源性。说明成功扩增了我国五指山猪来源的PERV-3'LTR,将有利于PERV全基因的克隆。

应用RNA干扰沉默猪内源性反转录病毒

目的:尝试应用RNA干扰(RNAi)沉默猪源PK-15细胞中的猪内源性反转录病毒(PERV),并通过反转录酶活性及pol基因相对荧光定量PCR检测沉默效果。方法:依据GenBank公布的PERV pol基因序列,采用Invitro-gen公司的BLOCK-iT RNAi Designer软件设计Stealth小干扰RNA(siRNA)序列;将合成的siRNA转染PK-15细胞,72 h后检测细胞上清PERV反转录酶活性及细胞内pol基因拷贝数并评价沉默效果。结果:反转录酶活性及pol基因拷贝数检测结果表明,设计的3条Stealth siRNA序列中,位于pol基因3272～3296 bp的序列能有效沉默PERV。结论:RNAi方法可有效使猪源PK-15细胞中的PERV沉默,为进一步研究天然抗病毒分子与PERV的相互作用提供了实验基础,同时也为猪源异种移植研究中去除PERV提供了一种可供尝试的方法。

中国巴马小型猪内源性反转录病毒的检测

目的 :对我国特有巴马小型猪内源性反转录病毒 ( porcine endogenous retrovirus,PERV)的存在与 m RNA的表达情况进行检测 ,了解巴马小型猪内源性反转录病毒的携带情况。方法 :根据以往建立的 PCR、RT-PCR检测方法 ,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的 DNA和RNA样品进行 PERV核心蛋白基因 ( gag)、多聚酶基因 ( pol)及囊膜基因 ( env)的存在与表达进行检测 ;同时 ,根据目前通用的 env基因分型方法检测 PERV env-A、env-B、env-C的存在与表达。结果 :在 1 2个被检的 DNA样品中均检出了PERV特异性 DNA的存在 ;同样 ,在 1 2个被检的 RNA样品中均有 PERV特异性 RNA的表达 ,且所表达的 PERV均为 A型和 B型 ;其中有9个 DNA样品检测出 PERV-C型的存在 ,所有样品中均未检出 C型 PERV的表达。结论 :检测结果表明 1 2个被检巴马小型猪基因组中存在着内源性反转录病毒序列 ,且能以 m RNA的形式表达 ,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。

五指山小型猪内源性反转录病毒囊膜基因变异特征研究

为分析近交系连续3代次五指山小型猪内源性反转录病毒囊膜基因(PERV-env)变异特征,本研究采用PCR方法对该基因进行扩增、克隆和序列测定,将其与参考序列比对和遗传进化分析。序列分析显示:PERV-env核苷酸序列与参考序列之间的同源性为98.3%～99.3%,具有明显G→A突变,并且偏好发生于GA、GG。进一步分析表明,在PERV-env序列190 bp和1 875 bp位置均有G→A突变发生。PERV-env基因遗传进化树分析表明,五指山来源的PERV与国外小型猪PERV-A亲缘关系较近,但仍存在差异。本实验将有助于PERV分子特性的研究,为进一步开展异种移植中PERV的安全性评价奠定基础。