PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化修复牙槽骨缺损

目的:探究PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化对牙槽骨缺损的修复作用。方法:培养骨髓间充质干细胞,(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),并转染anti-miR-132、anti-miR-NC质粒。制备BMSCs来源外泌体(bone mesenchymal stem cells-exosomes,BMSCs-exo),蛋白质印迹法鉴定表达标志物。制备PF-127水凝胶和BMSCs-Exo复合物,PKH67标记法检测BMSCs的摄取;茜素红染色检测BMSCs的成骨能力;逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测细胞中miR-132表达和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)mRNA表达。建立牙槽骨缺损大鼠模型,将大鼠随机分为PF-127水凝胶组、PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组。微型计算机断层扫描(Micro-computed tomography,micro-CT)评估牙槽骨缺损情况;蛋白质印迹法检测牙槽骨组织中ALP、OCN、Runx2蛋白表达。结果:anti-miR-132组BMSCs中miR-132表达明显低于anti-miR-NC组(P<0.05),提示anti-miR-132成功转染至BMSCs中。BMSCs-exo-anti-miR-NC组和BMSCs-exo-anti-miR-132组中外泌体标志物CD9和CD63显著表达。和BMSCs-exo-anti-miR-NC组相比,BMSCs-exo-anti-miR-132组中miR-132表达明显降低(P<0.05)。和PF127水凝胶组相比,BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组中miR-132表达均明显降低,茜素红染色相对活性、细胞中Runx2、ALP和OCN mRNA表达均明显增加,且PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组变化最显著(P<0.05)。和Control组相比,PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组BV/TV比值、BMD、Tb.N和Tb.Th及细胞中Runx2、ALP、OCN蛋白表达均明显升高,Tb.Sp明显降低(P<0.05),且PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组变化最显著。结论:PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞来源外泌体来源干扰miR-132表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,从而促进牙槽骨缺损大鼠的修复。

PF-127-LV-NTFs三维复合支架培养大鼠神经干细胞

目的观察Pluronic F-127(PF-127)水凝胶负载编码慢病毒LINGO-1 shRNA(LV)及神经营养因子混合物(NTFs)(PF-127-LV-NTFs)三维复合支架对大鼠神经干细胞(NSCs)增殖分化的影响。方法构建慢病毒(LV)后以不同感染复数(MOI)感染NSCs,用RT-qPCR及Western blot检测NSCs中LINGO-1的表达;按照一定比例将脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经胶质细胞来源的神经营养因子(GDNF)配制成NTFcocktail(NTFs),PF-127水凝胶负载LV和NTFcocktail并分组培养NSCs;用CCK-8法检测NSCs的细胞活力,LIVE/DEAD染色检测NSCs的存活率,免疫荧光染色检测NSCs增殖和分化情况。结果LV感染NSCs的最适MOI=5;PF-127对NSCs的细胞活力没有影响;PF-127+LV+NTFs组NSCs存活、增殖及神经元分化比例较高(P<0.01)。结论PF-127-LV-NTFs三维复合支架有利于大鼠NSCs的增殖和神经元的定向分化。