2017-2020年华东地区猪源多杀性巴氏杆菌耐药性和PFGE分析

为了解华东地区猪源多杀性巴氏杆菌的耐药情况及流行特征,本研究收集了2017—2020年华东地区分离的31株猪源多杀性巴氏杆菌,通过琼脂稀释法检测其对12种临床常用抗菌药物的最小抑菌浓度;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行分子分型探求菌株亲缘关系。结果显示:31株猪源多杀性巴氏杆菌,对复方新诺明的耐药率最高(61.29%),其次为泰妙菌素(32.26%)、氟苯尼考(25.81%)、多西环素(12.90%)和大观霉素(3.23%)。所有菌株对头孢噻呋、庆大霉素、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、恩诺沙星完全敏感;耐药谱型呈现多样化特点,31株猪源多杀性巴氏杆菌共表现为8种耐药谱型,其中有2株3药耐药菌株,耐药谱型分别为DOX+TIA+SPT和FFC+TIA+SXT;依据85%相似性标准可将其分为14个PFGE分型,其中A、G、H、J簇共有19株菌,占61.29%,并且PFGE分型相同的菌株耐药表型也高度相似。研究结果表明,华东地区猪源多杀性巴氏杆菌呈现耐药模式和PFGE分子分型多样化的特性,PFGE分型与耐药表型之间存在一定的相关性,应加强猪源多杀性巴氏杆菌的耐药性监测和流行性防控。

2019—2020年桂林市食源性沙门菌耐药分析及PFGE分型研究

目的了解2019—2020年桂林市沙门菌耐药情况及分子分型特征,以期了解桂林市食源性沙门菌的流行变化规律。方法对2019—2020年食源性风险监测及突发公共卫生事件检出的69株沙门菌进行血清分型,根据CLSI 2020推荐标准,采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(MIC),分析耐药性,以脉冲场凝胶电泳法(PFGE)进行分子分型。结果69株沙门菌分属20个血清型,优势血清型为鼠伤寒沙门菌(27.54%)和肠炎沙门菌(14.49%);2019年的32株菌共产生17个耐药谱,其中9株鼠伤寒沙门菌对四环素100%耐药;2020年的37株菌共产生24个耐药谱,其中10株鼠伤寒沙门菌对磺胺异噁唑100%耐药。69株沙门菌呈现出多个不同的基因型别。相同血清型的基因型比较相近,具有同源性,不同血清型的PFGE结果具有多态性。结论2019—2020年桂林市沙门菌的优势菌株为肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌,检出的沙门菌存在耐药现象,不同沙门菌菌株之间可能具有亲缘性关系。

乳房炎奶牛金黄色葡萄球菌毒素基因的检测及PFGE分型研究

作者针对临床及亚临床乳房炎奶牛乳汁中金黄色葡萄球菌分离株的毒素基因进行检测和脉冲场凝胶电泳(PFGE)基因分型,比较2种类型乳房炎金黄色葡萄球菌分离株的差异。无菌法采集奶样,采用国际标准方法从中分离金黄色葡萄球菌,用多重PCR方法扩增nuc基因和mecA基因以确证金黄色葡萄球菌(SA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。进一步用PCR方法检测SA的各种毒素基因(SEs、ETs、TSST-1和PVL基因等)。利用限制性内切酶SmaⅠ对SA基因组DNA进行酶切和PFGE分析,最后利用BioNumerics软件进行聚类分析。结果:19.3%(23/119)的临床乳房炎奶样和14.8%(26/176)的亚临床乳房炎奶样确定为金黄色葡萄球菌阳性样品,分别从中分离鉴定出43株和26株金黄色葡萄球菌,其中临床乳房炎分离株中有5株为mecA基因阳性。临床乳房炎奶牛奶样中检测到SA的SEA、SEB、SED、SEJ和PVL毒素基因,检出率分别为3.8%(1株)、11.5%(3株)、19.2%(5株)、7.7%(2株)和31.2%(10株);亚临床乳房炎奶牛乳样中仅检测到SA的SEA和PVL毒力基因,检出率分别为7.0%(3株)和84.1%(37株)。表明临床与亚临床乳房炎奶牛乳汁中SA菌株携带的毒素基因不一样,SEs可能是临床乳房炎菌株的重要致病基因,PVL可能是亚临床乳房炎菌株的重要致病基因。69株SA使用SmaⅠ酶切分型后,可分为7个大簇、50个基因型,来源相同的SA分型后大部分位于同一簇内。临床乳房炎奶牛乳汁中检测到MRSA菌株,PVL基因在亚临床乳房炎中的检出率为临床乳房炎的2.7倍。PFGE方法能较好的区分临床乳房炎和亚临床乳房炎的SA分离菌株。

鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌的污染分析及PFGE分型研究

目的了解鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌的分布和传播情况。方法参考GB/T4789.9-2008、SN0175-2010、ISO10272-1:2006、FDA/BAM:2001、USDA/FSIS:1998等方法组合出分离鸡源疑似空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)的方法,采用16SrDNA和hipO基因的二重PCR方法对其准确鉴定;采用SmaⅠ对83株空肠弯曲杆菌进行PFGE分型。结果从鸡肉生产链中采集样品519份,分离鉴定出空肠弯曲杆菌180株,分离率为34.87%。其中养鸡场和屠宰场鸡粪样空肠弯曲杆菌分离率分别为74.29%和66.38%,屠宰场和市场的鸡肉样中空肠弯曲杆菌的分离率分别为17.33%和13.66%。83株空肠弯曲杆菌通过PFGE分型结果产生了45种不同的谱型。结论四川省部分地区鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌的污染较严重,空肠弯曲杆菌在鸡肉生产链中可能存在水平传播现象。

奶牛乳源大肠杆菌耐药性、毒素基因鉴定及PFGE分型研究

通过采集中国北方地区某荷斯坦牛场生产群牛及乳房炎牛197份样品(195份奶样及2份洗布水样),分离出28株大肠杆菌菌株,并进行细菌药敏试验、毒力基因检测及PFGE分型,为牛场防治大肠杆菌型乳房炎提供数据支持。检测28株大肠杆菌对35种抗生素的敏感性发现,兽用临床抗生素庆大霉素和大观霉素应作为该奶牛场大肠杆菌型乳房炎的主要治疗药物。但该牛场出现了对非兽用广谱抗生素麦迪霉素的耐受性菌株,提示牛场在治疗奶牛大肠杆菌型乳房炎时应该注意用药问题。同时,洗布水样分离出的大肠杆菌的多重耐药性较强,也应引起重视,以便及时切断病菌传播途径。基于本研究在28株大肠杆菌中Ecs3703毒力基因的检出率为100%,证实所分离的大肠杆菌为肠出血性大肠杆菌(EHEC)而非肠毒素大肠杆菌(ETEC)。细菌毒力基因Irp2和CNF2的检出则暗示携带这两类毒力基因的大肠杆菌极可能为奶牛乳房炎致病菌。

动物、环境及饲养员多重耐药大肠杆菌的PFGE分型研究

目的了解养殖场多重耐药大肠杆菌耐药性的传播机制,探讨人、动物与环境间耐药菌垂直克隆传播的可能性。方法采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法对分离自养殖场动物、环境和饲养员的86株耐药谱相近多重耐药大肠杆菌进行DNA指纹图谱分型,比较菌株之间的亲缘关系。结果37株鸡场来源大肠杆菌可分为20种PFGE分型;49株猪场来源大肠杆菌可分为24种PFGE分型;同一动物、环境或饲养员采样点分离菌株PFGE指纹图谱相同者较多;同一养殖场不同动物个体、养殖场环境不同采样点、动物和环境以及饲养员和环境都存在PFGE指纹图谱完全相同菌株;鸡场和猪场都发现有属同一PFGE分型的来自动物、饲养员和环境的菌株;86株菌全部对环丙沙星、氨苄西林、链霉素、四环素、多西环素和复方新诺明耐药,相同PFGE分型的菌株其耐药谱型不一定相同。结论养殖场动物、环境及饲养员之间存在多重耐药大肠杆菌的克隆传播。

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳(PFGE)分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用DNA限制性内切酶NotI对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种(L.interrogans)不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论 3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L.interrogans种,上述两种方法对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪。

广东、海南、福建3省罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为研究近年来罗非鱼链球菌病流行菌株菌种与基因型变化信息,对广东、海南和福建3省罗非鱼主养区(共17个市县,93个养殖场)近4年的链球菌病流行菌株进行了分离,采用特异PCR方法对2009-2012年分离获得的流行菌株进行检测,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2009-2011年分离获得的流行菌株进行基因型分析。3省共分离到102株流行菌株,PCR鉴定结果显示均为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)。67株无乳链球菌PFGE图谱聚类显示产生A^G共7种PFGE带型,带型相似度在52.1%~100%之间。基因型A和D为广东优势菌群(93.48%,43/46),基因型F为海南优势菌群(66.7%,10/15),而福建6株分属于B、C和E共3个基因型。2009-2012年3省罗非鱼链球菌病流行菌种为无乳链球菌,流行菌株菌型较复杂,各省优势菌群存在较大差异,并且随时间发生变化。

宠物犬及犬粮源沙门氏菌的耐药性分析及PFGE分型

为了解宠物犬和犬粮源沙门氏菌的耐药表型特征与耐药基因分布,以及不同分离菌株之间的同源性,本研究采用K-B法测定27株分离菌的药物敏感性、PCR检测耐药基因、脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行基因分型。结果显示,27株沙门氏菌分离株对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、链霉素、复方新诺明、强力霉素耐药率在29.63%~22.22%,33.33%分离菌对3种及3种以上抗生素耐药,其中阿莫西林/克拉维酸-氨苄西林-复方新诺明-强力霉素所占比率最大,为66.67%(6/9);74.07%分离菌至少含有1种耐药基因,以str A-B、bla PSE、tet B、sul1检出率最高,分别为40.7%、37.0%、29.6%、25.9%,四环素类、氯霉素类、磺胺类、β-内酰胺类耐药基因与耐药表型符合率较高,分别为100%、100%、87.5%、72.7%;27株分离菌形成12种PFGE基因型,优势型别为pt1和pt7型。本研究结果表明宠物犬和犬粮源沙门氏菌呈现多重耐药,耐药表型与其相对应的耐药基因间存在密切的相关性;PFGE基因型呈多态性,而其与血清型之间不呈相关性,但与多重耐药菌株(耐>8)间存在一定程度的关联性。

2007年中国四省福氏志贺菌分离菌株的毒力基因检测和PFGE分析

目的分析中国河南等四省的福氏志贺菌分离菌株毒力基因和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型。方法应用PCR方法检测2007年从河南、青海、甘肃和山西分离的262株福氏志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、志贺肠毒素2基因(sen)、志贺肠毒素1基因(set1A)以及侵袭性蛋白基因(ipaBCD)。参考美国CDC的PulseNet实验方法 ,用限制性内切酶NotI对细菌染色体进行酶切,对这些分离菌株进行PFGE分析,使用BioNumerics软件进行聚类分析,并按照PulseNet命名原则对带型进行命名。结果 262株福氏志贺菌分离菌株ipaH、sen、set1A和ipaBCD基因的携带率分别为100%、93.89%、96.18%和92.75%。具有7种毒力基因携带模式,其中89.31%的菌株为Ⅰ型毒力基因携带模式(ipaH+sen+set1A+ipaB-CD+),有99.24%菌株同时携带两种或以上毒力基因。262株福氏志贺菌共分为83个PFGE型别,其中CNJZXN11.0002、CNJZXN11.0003、CNJZXN11.0060、CNJZXN11.0081、CNJZXN11.0137、CNJZXN11.0169、CNJZXN11.0190、CNJZXN11.0195、CNJZXN11.0196、CNJZXN11.0199、CNJZXN11.0217、CNJZXN11.0325和CNJZXN11.0327为13种主要带型。CNJZXN11.0003型菌株在4省均有分布,CNJZXN11.0199为河南菌株的优势带型,CNJZXN11.0137、CNJZXN11.0325和CNJZXN11.0327为山西特有的PFGE带型,与CNJZXN11.0003等主要带型聚类相似性较小。结论四省分离的福氏志贺菌株中ipaH、sen、set1A和iPaBCD毒力基因的携带率较高,而且这些菌株的PFGE型别既具有地区性差异,又具有优势型别的交叉。

福建省嗜肺军团菌血清1型及血清6型菌株PFGE分型研究

目的研究福建省2008年至2010年公共场所空调冷却塔水及冷凝水中分离的嗜肺军团菌血清Ⅰ型(LP1)及血清Ⅵ型(LP6)的基因特征。方法应用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技术对57株LP1型军团菌及15株LP6军团菌进行电泳,并用BioNumerics(version 6.0,Applied Maths,Inc)软件包对其进行聚类分析。结果 57株LP1军团菌可分为40种PFGE型,菌株间相似性系数在24.107%～100.000%之间不等,大部分菌株的PFGE型别差异明显,无优势型别。不同地区分离的LP1军团菌既有差异较大的带型,也存在相同和相似的带型;相同地区,菌株间相似性系数存在差异,无优势菌株。15株LP6军团菌可分为12个不同的PFGE型别,菌株间相似性系数在27.87%～100.00%之间。结论 2008-2010年福建省公共场所空调冷却塔水及冷凝水中分离的LP1及LP6军团菌呈现基因多样性。

O1群霍乱弧菌PFGE分子分型和菌株流行能力关系研究

目的调查福建省1962-2005年不同流行时期、不同流行血清群的O1群埃尔托型霍乱弧菌(EVC)的菌株间的遗传关联度和基因组的多态性;探讨不同PFGE型(簇)和霍乱菌株流行能力的关系。方法运用脉冲场凝胶电泳分子分型(PFGE)技术,对福建省1962-2005年代表性霍乱菌株进行分型,结合流行病学背景资料探讨不同PFGE型(簇)和相关霍乱菌株的流行能力。结果 77株霍乱菌株按100%的相似度分为61个PFGE型,按照90%的相似度可得到5个主要的PFGE簇,命名为G1-G5;52株小川型霍乱弧菌,按照100%的相似度分为47个PFGE型,按照90%的相似度可得到4个主要的PFGE簇[G1(o)-G4(o)];25株稻叶型霍乱弧菌按照100%的相似度分为15个PFGE型,按照90%的相似度,可得到2个主要的PFGE簇[G1(i)-G2(i)]。各个流行时期的菌株均有优势的PFGE簇,散发的菌株呈现分散的PFGE型,没有集中趋势。结论福建省3次流行的霍乱菌株有遗传关联性,在流行过程中产生基因变异出现新的优势PFGF簇;各地区间的霍乱流行有传播上的相关性。小川型G2(o)PFGE簇和稻叶型G1(i)PFGE簇的菌株有引起霍乱持续流行的能力,后者更有引发大规模病例数的能力。

市售猪肉中沙门氏菌耐药基因与毒力基因筛查及PFGE分型研究

为了解市售猪肉中沙门氏菌耐药基因和毒力基因携带状况,以及PFGE分子分型情况,用PCR方法对分离的22株沙门氏菌携带的耐药基因和毒力基因进行检测,并运用XbaⅠ酶进行酶切后完成PFGE分析,再利用BioNumerics软件对分离菌株的指纹图谱进行聚类分析。结果显示:分离菌株对氨苄西林的耐药性最严重,耐药率为72.73%,其次是对氟苯尼考,耐药率为68.18%;在10种耐药基因检测中,共检出9种;除喹诺酮类药物外,分离菌株耐药基因与耐药表型的符合率为95%,其中88%的分离菌株携带酰胺醇类耐药基因(catI)和β-内酰胺类耐药基因(blatem-1/blapsE-1/blaCMY-1/blaoxA-1)。在14种毒力基因检测中,共检出13种;所有分离菌株均携带mgt C和bcfA毒力基因,其次是mogA、araB、stn、fimA毒力基因,携带率均为95.45%;22株沙门氏菌共分为10个群,包括8个带型,菌株相似度为60%～100%。结果表明:市售猪肉中的沙门氏菌携带多种耐药基因和毒力基因,须采取措施防止沙门氏菌污染猪肉产品。

云南省鼠伤寒沙门氏菌PFGE分子分型及耐药情况

目的了解云南省鼠伤寒沙门氏菌PFGE分子分型及耐药状况,为防控由鼠伤寒沙门氏菌引起的疾病提供科学依据.方法根据Pulse Net China公布的沙门氏菌PFGE分型技术进行分子分型.分析得出药敏板MIC值,根据CLSI的相应标准获得出S、I、R结果.结果云南省68株鼠伤寒沙门氏菌呈53种PFGE带型.68株鼠伤寒沙门氏菌对复合磺胺(SXT)的耐药率最高,为45.59%,对亚胺培南(IMP)最敏感.其中1株菌对14种抗生素中11种抗生素耐药.结论云南省鼠伤寒沙门氏菌分子分型呈多样性.复方磺胺是云南地区鼠伤寒沙门氏菌最耐药抗菌素.地区鼠伤寒沙门氏菌多重耐药不典型.

河南省20株布鲁氏菌鉴定与PFGE分子分型研究

目的 检测与分析河南省2010-2012年20株布氏菌型别及PFGE脉冲场凝胶电泳指纹图谱特征。方法 采集病人静脉血,分别以试管凝集试验（SAT）、双相血培养瓶分离培养、热裂解法制备DNA模板和AMOS-PCR鉴定4种布氏菌型别。采用脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）对检出的布鲁氏菌进行分子分型鉴定。结果 分离培养的20株布鲁氏菌经鉴定,19株为羊种,1株为牛种;羊种布鲁氏菌经XbaI酶切与脉冲场凝胶电泳后,共获得了8种不同带型,带型相似度在80%~100%之间,牛种与羊种菌株在带型相似度上差异较大,具有较好的分辨能力。结论 河南省病人感染的布鲁氏菌以羊种为主要型别,AMOS-PCR与PFGE作为布鲁氏菌菌型鉴定与分子分型的技术手段,为布鲁氏菌病的病原学监测与应急检测提供依据。

嗜肺军团菌SBT、PFGE、AFLP分子分型方法的比较

比较SBT、PFGE、AFLP三种分子分型方法在嗜肺军团菌分型研究中的分辨力,探讨SBT方法在嗜肺军团菌分型中的可应用性。收集石家庄市6所医院冷却塔水中分离的32株嗜肺军团菌,对其中的24株血清I型嗜肺军团菌进行SBT分型研究,并与PFGE和AFLP分型结果进行了比较。24株LP1型嗜肺军团菌共分为4个ST型,分辨系数为0.239 1。PFGE方法将32株菌株共分为15个PFGE型,分辨系数为0.925 4。AFLP方法将32株菌株分为23个AFLP型,分辨系数为0.973 7。通过比对EWGLI网站SBT数据库,ST1021型和ST345型为本地区独特型别且属于同一克隆系;ST1型为优势型别并在我国长期流行;由于缺失neuA而未分型的嗜肺军团菌株与其他23株菌分属于不同的克隆系。SBT方法的分型能力不及PFGE方法和AFLP方法。但SBT分型方法能够通过全球比对数据库得到更多的关于菌株遗传进化和流行分布的资料,在研究菌株分子流行病学及进化方面优于PFGE和AFLP方法。

肠炎沙门菌PFGE分子分型及耐药性研究

目的：对本地区及相邻地区2004～2007年分离的肠炎沙门菌菌株的分子分型及耐药性进行分析。方法：采用PFGE进行分子分型,利用药敏卡通过仪器对分离菌株进行药敏检测。结果：5起肠炎沙门菌食物中毒分离的菌株分成3型,其中2型之间存在3条带的差异,菌株间有相近关系。结论：PFGE是一种非常有效的分子分型方法,建立细菌PFGE指纹图谱数据库及PulseNet,对于控制食源性疾病非常重要。

PFGE在识别和追踪医院感染暴发及流行中的应用

医院感染是危害医疗安全最重要的原因之一，据美国疾病预防控制中心统计每年约有200万住院病人发生医院感染，占住院总数的5％～10％，同时会导致每年约88000人死亡以及带来45亿美元的经济损失，而近年来随着广谱抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂等药物的广泛使用，各种侵入性诊疗措施的不断增多．由多重耐药菌株引起的医院感染暴发流行时有发生，有学者估计可能为5％。

重庆市2007年临床分离79株沙门菌耐药性及PFGE分型研究

目的:对重庆市2007年分离的人群沙门菌菌株进行耐药性和PFGE分子分型研究。方法:全自动细菌生化鉴定仪(VITEK32)和血清学鉴定分离的人群沙门菌,利用K-B法对分离菌株进行药敏检测,并采用PFGE进行分子分型。结果:2007年共分离鉴定79株12种沙门菌(11种血清型和1组B群),全部菌株对至少一种抗菌素耐药,75%(9种)对3种以上的抗菌素耐药,16.67%(2种)对6种抗菌素耐药,尤其是里定沙门菌、婴儿沙门菌及汤卜逊沙门菌耐药严重。沙门菌被分成9种PFGE型14种亚型。结论:重庆市2007年人群沙门菌分离株没有明显的优势流行株,同一事件中的沙门菌PFGE分型相同,分离株耐药情况严重,分离菌株的耐药谱和PFGE型也没有明显的联系。

肠球菌为主要菌群的腹泻标本的16S rRNA与PFGE分析

目的了解肠球菌为主要菌群的腹泻标本的微生态及分离肠球菌菌株的克隆特征。方法根据细菌16S rRNA保守区序列设计通用引物,以腹泻病人粪便标本中的总DNA为模板,PCR扩增16S rRNA片段。将获得的片段克隆入T载体进行测序,与数据库中发表的序列进行比对,判断标本中细菌的种类和比例,并对每份标本分离的各50株肠球菌选择20株进行PFGE分析。结果对4份标本的多次16S rRNA序列分析表明,该4份标本均以Enterococcus faecium为主(所占比例>68%),PFGE结果显示每个病人分离屎肠球菌菌株是克隆性的(一份标本除外)。结论从16S rRNA和PFGE的角度对腹泻粪便标本进行了分析,得到腹泻儿童肠球菌分布的基本特征,其致病性和相关机理还待今后实验范围的进一步扩大和研究的深入。