超螺旋PGEM-1重组质粒的提取、纯化与鉴定

本文采用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ层析法去除粗提物中的ＲＮＡ，用０．７％低融点琼脂糖凝胶回收超螺旋质粒，使质粒的纯化过程费时较少且获得令人满意纯度的超螺旋质粒。

h TNF-α cDNA的酶切鉴定

本文对Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ２Ｂ层析分离后的重组质粒ｐＧＥＭ－１用Ｅ ＣＯＲ汲ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶进行切割，电泳分析结果表明用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ层析分离的质粒纯度可满足于克隆片段的酶切图谱分析。

牛金属硫蛋白素bMTcin编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

以本实验室由RT—PCR扩增得到的含有牛金属硫蛋白(bMT)cDNA的重组质粒pYJ101为模板,PCR扩增出牛金属硫蛋白素bMTcin的编码区,将其克隆到pGEM—T载体上并进行DNA序列测定。利用融合表达载体pGEX4T—1,在E.coli中诱导表达bMTcin,经过Glutathine Sepharose 4B亲和层析纯化后,SDS—PAGE检测GST:bMTcin的条带。结果表明,所克隆的bMTcin序列全长为141bp,其DNA序列与原模板中的序列完全相同,与GenBank中另外5个bMTcin DNA相比,第31位和86位与Conneely的序列为A和G,导致第11位(Thr)和29位(Arg)的氨基酸不同于其他4个序列(11位为Ala,29位为Lys)。融合表达产物亲和层析纯化后,用SDS-PAGE检测可见融合蛋白GST:bMTcin的条带,紫外分光光度计测定,融合蛋白GST:bMTcin的表达量大约为1.1mg/L发酵液。