果实表达PGIPs的基因克隆及功能研究进展

多聚半乳糖醛酸酶(PGs)是病原真菌早期侵染植物的一个重要致病因子。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)作为植物防御蛋白,能特异性抑制真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶,并通过延长寡聚半乳糖醛酸(OGs)的稳定期激活植物防御反应。综述PGIPs在植物细胞中的定位,PGIPs与PGs之间的作用方式,PGIPs基因的分离与克隆,以及PGIPs对果实感病的影响,并对PGIPs的研究前景进行展望。

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的结构、功能以及应用研究进展

真菌病害严重影响植物的生长发育。为了自我保护,植物进化出了许多抵御病原真菌入侵的策略,例如防御相关蛋白的产生。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting proteins,PGIPs)是近年来研究较多的一种植物防御蛋白,它能与真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases,PGs)特异性结合,降低PGs水解植物细胞壁的活性并在植物体内累积能激活多种防御反应的长链寡聚半乳糖醛酸(oligogalacturonides,OGs),从而达到抑制真菌侵染的目的。主要介绍了PGIPs的结构、功能及其抗菌机理,并综述了PGIPs在国内外转基因抗病育种中的应用研究进展。

烟草PGIP基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据Gen Bank数据库报道的林烟草(Nicotiana sylvestris)PGIP基因c DNA序列,设计特异性引物,从普通烟草(Nicotiana tabacum)种植品种小黄金中分离得到了其g DNA序列,分析结果发现烟草PGIP基因没有内含子序列。信号肽分析结果表明,烟草PGIP基因含有一段长28个氨基酸的信号肽。将去除信号肽的烟草PGIP基因片段亚克隆至枯草芽孢杆菌表达载体p HT43中,转化枯草芽孢杆菌菌株WB600并进行IPTG诱导。SDS-PAGE电泳表明,重组菌株可成功表达目的蛋白质,分子质量符合预期大小;琼脂扩散试验结果发现,表达的烟草PGIP蛋白质能够明显抑制辣椒疫霉PGs的活性。

梅PGIP基因的克隆及全序列分析

通过PCR扩增,从梅基因组中得到1条全长1 192 bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)基因序列。该序列包含有1个完整的开放阅读框和1个内元。比对结果表明,克隆到的序列与桃、马哈利樱桃中相应序列一致度分别为96%和95%,其蛋白质序列与桃、马哈利樱桃的蛋白质序列一致度分别为97%和94%。该蛋白质序列中包含着一段亮氨酸重复序列。

小麦多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白对几种病原真菌抑制作用的研究

本文以单子叶植物小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）的黄化苗为材料，用小麦品种ＳＷ８９－２５８９的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（ＰＧＩＰ）作用４种病原真菌，发现小麦ＰＧＩＰ对几种病原真菌分泌的内切多聚半乳糖醛酸酶（ｅｎｄｏ－ＰＧ）有抑制作用，４种病原真菌ｅｎｄｏ－ＰＧ被抑制程度的大小关系依次为Ｐｙｒｉ－ａｃｌａｒｉａｏｒｙｚａｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍｔｕｒｃｉｃｕｍ；小麦ＰＧＩＰ对４种病原真菌生长有抑制作用，并且能引起小麦禾谷镰刀菌和玉米大斑病菌生长异常。

中国李PGIP基因的克隆及序列分析

以中国李叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列为引物,扩增到1条全长1 192 bp的目的片段（Genbank登录号：DQ200847）.序列分析表明：该片段与杏、桃、马哈利樱桃、梅的PGIP基因序列一致度达96%～99%,包含有1个完整的开放阅读框和1个内含子,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列;分子进化分析表明,在分子进化树中,该序列与杏、桃、马哈利樱桃、梅的PGIP序列位于同一类.为植物分子抗病育种提供了1条基因资源.

龙眼梅PGIP基因的克隆及序列分析

利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在龙眼梅(PrunusmumeSiebetZucc.Longyan)嫩芽中特异性表达的PGIP基因。DNA序列分析表明,所获得龙眼梅的PGIPcDNA的序列全长为1045bp,该序列与已发表的PGIP基因有很高的同源性。

转梅PGIP基因增强菊花抗病性研究

通过农杆菌介导法将梅多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(PGIP)转入盆栽小菊品种‘05-44-2’中,以提高对真菌病害的抗性。经Hyg抗性筛选,获得232株抗性苗。对其中40株进行PCR检测,有8株扩增出目的条带;对这8株进行RT-PCR检测,发现其中有5个株系有目的条带出现,且发生基因转录。转基因菊花的抗病性检测证实,与对照相比,转基因株系对黑斑病有不同程度的抗性,表现为发病延迟,病情指数降低;株系7抗性最强,其苗期病情指数仅为33。

小麦在与水杨酸诱导的应答过程中PGIP的积累

以SW8 9 2 5 89小麦品系为材料 ,利用自制的小麦抗PGIP血清和dot immunobindingassay ,并结合PGIP粗提液对endo PG的抑制实验 ,研究了小麦内源多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 (PGIP)水平与水杨酸之间的应答关系 .发现用水杨酸处理过的PGIP粗提液在NC膜上的显色斑点颜色均较H2 O处理的PGIP粗提液深 ,而且对en do PG的抑制程度也高于未用水杨酸处理的PGIP粗提液 .这充分说明水杨酸能诱导小麦内源PGIP水平稳定的提高 .此结果为进一步弄清PGIP抗病机理提供了有用的资料 .图 4表 1参

马哈利樱桃PGIP cDNA克隆及序列分析

以马哈利樱桃 (Prunus mahaleb L .)为材料 ,通过 RT- PCR获得了 1 0 4 5 bp的目的片段 ,经克隆测序 ,证实该片段包含 1个完整的开放阅读框架 ,该阅读框架由 990碱基组成 ,编码 3 3 0个氨基酸。该序列与杏、梨、苹果的 PGIP c DNA序列同源性分别达 97.2 %、83 .4%和83 .6 % ,可能编码的氨基酸与杏、梨、苹果的 PGIP c DNA所编码的氨基酸的同源性分别达到96 .7%、85 .2 %和 85 .2 %。与已经克隆的 PGIP DNA序列的对比分析表明 ,PGIP DNA序列中包含 2个外显子和 1个内含子 ,内含子全长 1 47bp,符合 TG- AG规律 ,2个外显子长度分别为 5 81 bp、46 4

桃PGIP基因及其启动子的克隆与分析

桃流胶病是一种严重危害桃树的真菌性病害,为研究PGIP基因在桃抗流胶病及抗其它真菌性病害中的作用,本研究以桃抗流胶病品种‘南京白沙’叶片为材料,对其PGIP基因及启动子序列进行克隆与分析。克隆测序获得了‘南京白沙’桃PGIP基因cDNA序列(GenBank登录号:HQ453972)和PGIP基因组DNA序列以及起始密码子上游453bp的启动子序列(GenBank登录号:HQ453974),并将该PGIP基因命名为PpPGIP2。‘南京白沙’桃PpPGIP2序列分析显示,该DNA序列具有完整的阅读框,无内含子,与GenBank中登录的李属PGIP基因序列同源性在93%～98%之间,与测序完成的桃全基因组中该基因的序列同源性为96%;PpPGIP2编码的氨基酸序列分析显示,该氨基酸序列含有2个典型的亮氨酸重复序列,信号肽为第1～第24个氨基酸残基;PGIP基因的序列聚类图显示,除了科、属、种间的同源性差异外,桃的种内PGIP基因同源性也有较大差异;PpPGIP2启动子序列分析发现3个抗病相关元件,分别为:GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A和WBOXATNPR1,另外还有与激素调控、胁迫有关的调控元件。本研究对‘南京白沙’桃PGIP基因和启动子的克隆与分析,将为进一步研究桃PGIP基因的表达调控及其功能分析提供参考。

九台晚李PGIP基因的克隆及生物信息学分析

以九台晚李叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列设计引物,PCR扩增到1条全长1192bp的目的片段（GenBank登录号：GU068978）。该基因包含有1个完整的开放阅读框,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长990bp,编码330个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列。序列分析表明：该基因与中国李、杏、桃、马哈利樱桃、梅等李属植物的PGIP基因序列一致度达95%-99%。系统进化分析显示出属内亲缘关系较近、属间亲缘关系较远的特点。该序列为植物分子抗病育种提供了1条新的基因资源。

梅PGIP基因的启动子克隆及生物信息学分析

根据梅PGIP基因（GenBank登录号：DQ364056.1）5′端序列设计特异反向引物,利用染色体步行法获得了该基因上游1 037 bp的启动子序列.启动子结构分析表明,梅PGIP基因启动子序列与中国李PGIP基因启动子显著相似,相似度达89%~96%,较中国李PGIP基因启动子多一个100 bp的区段,与水稻和豆的启动子序列均无Blast比对结果.转录调控元件预测结果表明,克隆序列与豆相应序列的保守区存在着能调控抗病基因转录的GT1结合位点.

小麦PGIP的免疫组织细胞化学定位

通过电镜及光镜采用酶免疫组织化学技术 ,快速组织印迹及dot immunobindingassay研究了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 (Polygalacturonaseinhibitingprotein ,简称PGIP)在小麦组织细胞中的定位分布及含量 .结果表明 ,PGIP主要集中分布于维管系统和表皮 ,亚细胞水平定位于与细胞壁连接的外侧细胞质膜和细胞质中 ,同一品种小麦的不同器官PGIP含量不同 ,其中茎的PGIP含量最高 ,根次之 ,叶中最少 .对小麦PGIP的分布定位与其功能关系进行了讨论 。

紫花苜蓿PGIP同源基因克隆与序列核苷酸多态性分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是植物重要的防卫蛋白之一,了解PGIP基因的核苷酸序列是对其进行分子遗传学与分子生物学研究的前提与基础。本研究采用同源克隆法,从16个紫花苜蓿(Medicago sativa)品种的集群DNA中克隆了7个苜蓿PGIP基因的部分基因组编码序列,分别对应于蒺藜苜蓿(M.truncatula)7个不同的PGIP基因,并命名为Ms PGIP5、Ms PGIP6、Ms PGIP7、Ms PGIP8、Ms PGIP9、Ms PGIP10和Ms PGIP11。其中,Ms PGIP5、Ms PGIP6、Ms PGIP8、Ms PGIP9和Ms PGIP11的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点间的平均距离分别为20、74、34、423和21 bp,差异较大。对Ms PGIP5、Ms PGIP6、Ms PGIP8和Ms PGIP11进行荧光标记PCR单链构象多态性(FPCR-SSCP)分析,结果表明,其等位基因数目与PCR片段长度的比值分别为20、56、22和19 bp,变化趋势与这4个基因SNP位点间的平均距离基本一致。比较而言,在发现的7个苜蓿PGIP基因中,Ms PGIP9序列高度保守,Ms PGIP5和Ms PGIP11的变异较大,而Ms PGIP6与Ms PGIP8的变异中等。

中矮1号梨砧木(S_2)PGIP基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,根据GenBank中梨属PGIP基因序列设计1对特异引物,以梨矮化砧木S2叶片总RNA为模板,克隆到1条约1100bp的cDNA片段,将其与pMD18-Tvector连接后转化Escherichia coli JM109,对筛选到的阳性克隆进行序列测定并使用生物信息学方法对所得结果进行综合分析。结果表明,克隆片段为梨PGIP基因,该cDNA编码330个氨基酸,预测分子量为36388ku,第1～24个氨基酸残基是信号肽。与梨属其它种中已获得的PGIP核苷酸序列开放阅读框(Open reading frame,ORF)的同源性为97.5%～99.6%,氨基酸序列的同源性为97.6%～99.1%。

云南野生中华猕猴桃PGIP基因的克隆与分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是存在于多种植物细胞壁中的一种糖蛋白,它能专一性识别真菌多聚半乳糖醛酸酶并抑制其活性,并能在一定程度上抑制真菌对植物细胞壁的降解。该蛋白在植物抵制真菌病害的发生中发挥着重要作用。文中利用PCR技术,从抗病能力较强的云南野生中华猕猴桃中成功地克隆了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(PGIP)的完整开放阅框架,并对其进行了序列和BLAST比对分析,此外,还通过生物信息学分析,对该基因氨基酸序列进行了结构域分析和蛋白质高级结构预测。结果表明:所得的PGIP基因996 bp为一个完整的开放阅读框,编码332个氨基酸;该片段与其它植物中的PGIP有很高的同源性,其与美味猕猴桃的同源性最高(达99%),与美洲李、越桔灌蓝莓和葡萄的PGIP基因的同源性分别为96%、78%、72%。该基因的成功克隆与文中的分析结果,为后续的基因功能确证及猕猴桃品种改良打下了基础。

Endo-PG诱导培养小麦细胞PGIP产生的研究

The activity of polygalacturonase inhibiting protein (PGIP)was assayed in four kind of cultures induced endo-polygalacturonase (endo-PG). It was discovered that endo-PG stimulated obviously the accumulation of PGIP. The PGIP contents of SuMai No. 3 and SA-Ⅱ cells,which are fungal disease-resistant,are higher than the contents of Mian Yang No. 11 and JingHua No.1. It is indicated in cell level that PGIP has relation to resistance of plant.

草原樱桃PGIP基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆草原樱桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因,并进行生物信息学分析。以草原樱桃叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列设计引物,通过PCR扩增获得约1 kb的DNA片段。序列分析表明,该基因全长1 193 bp,包含有1个完整的开放阅读框,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长990 bp,编码330个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列,GenBank登录号为GU068977;该基因与中国李、杏、桃、马哈利樱桃、梅等李属植物的PGIP基因序列一致度达95%～99%。系统进化分析显示,属内亲缘关系较近、属间亲缘关系较远的特点。克隆了草原樱桃PGIP基因,为樱桃抗病育种提供一条新的基因资源。

苜蓿多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白2(MsPGIP2)基因多态性分析

本研究旨在分离苜蓿多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白2(MsPGIP2)基因的基因组序列全长,分析序列变异。首先采用引物热不对称PCR的基因组DNA步移法分离其基因组序列全长,然后通过克隆测序分析了MsPGIP2基因在3个苜蓿品种(‘润布勒’、‘苏普斯坦’与‘公农1号’)中的多态性。结果显示,MsPGIP2基因的基因组DNA序列全长1 126bp,可分为信号肽、内含子和LRR区3部分。MsPGIP2基因的基因组序列中共有46个变异位点(频率>0.02)。在信号肽区,没有变异位点;在内含子区,有5个SNP位点和2个InDel变异位点;而在LRR区,共发现了39个SNP位点,其中非同义突变占61.5%。在3个苜蓿品种中共发现了15个等位基因(即单倍型),通过对LRR区核苷酸的系统发育分析将他们分成3类。结论认为,MsPGIP2基因具有较大的变异,各等位基因间发生了频繁的重组交换,是一个为适应病原微生物PG的进化而快速进化的基因。