18β-甘草次酸通过PGK1糖酵解途径抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡研究

基于磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)介导糖酵解途径研究18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid,GA)抑制氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)诱导的血管内皮细胞凋亡的分子机制。采用oxLDL(100 mg/L)损伤建立体外人主动脉内皮细胞损伤模型,并给予不同浓度的GA(10、20和40μmol/L)及PGK1激动剂进行干预,Western blot法检测糖酵解关键酶PGK1、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)、己糖激酶(hexokinase 2,HK2)和丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)表达水平以及凋亡相关Bax、Bcl2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平,比色法检测细胞内乳酸和葡萄糖含量。结果表明,与对照组相比,oxLDL组内皮细胞葡萄糖消耗减少、乳酸分泌量增加,PGK1、GLUT1、HK2、PKM2、Bax、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-9蛋白表达水平增加(P<0.05);与oxLDL组相比,GA治疗组(10、20和40μmol/L)内皮细胞葡萄糖消耗增加、乳酸分泌量减少,PGK1、GLUT1、HK2、PKM2、Bax、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.05);加入PGK1激动剂后可以逆转GA对oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡的作用。以上结果表明,GA通过抑制PGK1介导的糖酵解途径进而抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡。

与代谢酶PGK1相关的翻译后修饰在肿瘤发生发展中的作用研究进展

磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase-1,PGK1)是糖酵解途径中第一个催化ATP生成的关键酶,主要功能是催化1,3-二磷酸甘油酸(1,3-bisphosphoglycerate,1,3-BPG)转化为3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate,3-PG),并且通过底物水平磷酸化产生ATP。PGK1不仅具有代谢酶活性,在糖酵解过程中发挥重要作用,还具有蛋白激酶活性,可参与多种生命活动的调控,如介导血管生成、细胞自噬、DNA复制和修复、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环、肿瘤细胞增殖和转移等。在医学生物领域,翻译后修饰对基因稳定遗传、蛋白质定位、细胞代谢调控、DNA转录和翻译等至关重要。近年来研究表明,与PGK1相关的各种翻译后修饰在肿瘤的发生发展中起着重要的生物学作用,这不仅推动了癌症发病机制的研究,更为肿瘤患者提供了新的治疗方案。本文综述了PGK1翻译后修饰在肿瘤发生发展中的生物学功能研究。

牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白pgk抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为评价牛乳腺炎无乳链球菌重组表面蛋白(pgk)免疫原性,并通过建立检测抗体的间接ELISA方法对免疫抗体效价进行评价,本研究根据GenBank登录的无乳链球菌pgk基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板PCR扩增出pgk蛋白抗原优势区的编码基因序列。将其插入pET-30a(+)中,并在大肠杆菌中表达。Western blot鉴定表明,表达的重组蛋白与阳性血清具有良好的反应原性。采用纯化的表达产物作为包被抗原建立了检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.115μg/mL,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶4 000。初步应用于检测无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌小鼠阳性血清的检测。结果表明牛乳腺炎无乳链球菌pgk亚单位抗原具有良好的抗原性,抗体检测灵敏度达到1∶4 000,同时表现良好的特异性。

工业酿酒酵母PGK启动子的克隆与功能分析

为了获得适用于构建工业酿酒酵母整合型表达载体的组成型启动子,以工业酿酒酵母南阳K基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到了磷酸甘油酸激酶基因起始密码前的启动子片段2个,其中长片段781bp,命名为PGK1(GenBank Acession No.FJ415226)。NCBIBlast软件分析结果表明,PGK1核苷酸序列与酿酒酵母染色体Ⅲ上PGK启动子(GenBank Acession No.X59720)相似性为99%,序列中含有基因表达所需的基本调控元件TATA-box和CAAT-box等。功能分析表明PGK1能驱动整合在工业酿酒酵母基因组上的外源基因葡萄糖淀粉酶基因的表达。综上表明成功克隆得到PGK1启动子,为工业酿酒酵母表达载体的构建奠定了基础。

猬草及其近缘属植物单拷贝核Pgk1基因序列的系统发育分析

文章对禾本科小麦族猬草属及其近缘属Thinopyrum(Eb)、Lophopyrum(Ee)、拟鹅观草属(St)、新麦草属(Ns)、大麦属(H)、赖草属(NsXm)和披碱草属(StH)植物共23个类群的单拷贝核Pgk1基因序列进行系统发育分析,探讨猬草属及其近缘属植物的系统发育关系。序列分析发现Pgk1基因序列在L.arenarius和Psa.juncea中有81bp的Stowaway家族DNA转座元件插入,而在Hy.duthiei、Hy.duthieissp.longearistata和L.akmolinensis中有29bp Copia家族的反转录转座元件插入。最大似然和贝叶斯推断进行的系统发育分析表明:(1)猬草属模式种Hy.patula与披碱草属、拟鹅观草属和大麦属具有密切的亲缘关系;(2)猬草属的其他物种Hy.duthiei、Hy.duthieissp.longearistata、Hy.coreana和Hy.komarovii与新麦草属和赖草属植物亲缘关系密切。研究结果支持将Hy.patula从猬草属组合到披碱草属中,而Hy.duthiei、Hy.duthieis sp.longearistata、Hy.coreana和Hy.komarovii应组合到赖草属中。

基于奶牛乳腺炎无乳链球菌rSip-PGK-FbsA融合蛋白的间接ELISA检测方法的建立

为建立一种快速而准确的奶牛乳腺炎无乳链球菌抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的无乳链球菌的膜表面相关蛋白SIP、磷酸甘油激酶PGK及纤连蛋白FbsA 3种串联表达的融合蛋白rSip-PGK-FbsA为包被抗原,建立了检测奶牛无乳链球菌抗体的间接ELISA方法。该方法与化脓性链球菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、金黄色葡萄球菌阳性血清、表皮葡萄球菌阳性血清均无交叉反应,特异性良好;阳性血清稀释至1颐12 800仍检测为阳性,具有较高的敏感性;批内和批间试验变异系数均小于10%,重复性好。利用该方法与以SIP、PGK单一蛋白建立的ELISA方法对160份已知样品进行检测,结果显示,该方法的阳性符合率达到98.6%,高于SIP、PGK单一蛋白建立的ELISA方法的阳性符合率。对389份临床样品进行奶牛无乳链球菌抗体检测,其阳性检出率为46.53%。本研究建立的间接ELISA方法为奶牛无乳链球菌的快速检测提供了一种更加准确、可靠的血清学方法。

含PGK启动子慢病毒表达质粒的构建与鉴定

为了构建一个含有人源PGK1(human phosphoglycerate kinase 1)启动子的慢病毒表达载体pL-PGK-GFP.采用PCR从人组织中扩增PGK1基因的启动子部分,再用酶切-连接的方法将扩增的启动子区片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-EGFP中,再用测序、酶切和瞬时表达的方法进行鉴定.结果是下游的eGFP基因在PGK1启动子驱动下,在293FT细胞中表达绿色荧光蛋白报告基因,这表明成功构建了慢病毒表达质粒pL-PGK-GFP.扩增的537bp PGK1启动子片段具有一定的启动效率,能在HIV来源的慢病毒载体中驱动下游目的基因的表达.

马链球菌兽疫亚种PGK蛋白的免疫保护试验

为了阐明马链球菌兽疫亚种(SEZ)PGK蛋白的免疫保护作用,使该菌引起猪、马、牛等多种动物的链球菌病得到有效控制,本试验构建PGK重组表达载体,纯化重组蛋白,对其免疫效力进行系统评价。结果表明:PGK蛋白可以诱导高滴度的血清Ig G抗体,并且可提供一定的免疫保护效力;Real-time PCR技术分析表明,PGK是一个重要的体内诱导抗原;并且可诱导高水平的Th1和Th2型免疫应答,揭示PGK在SEZ治病过程中起到重要作用,为新型疫苗的研制奠定了基础。

PGK1基因变异致磷酸甘油酸激酶1缺乏症1例临床与遗传学分析

目的探讨PGK 1基因变异致Ⅸ型糖原累积病(磷酸甘油酸激酶1缺乏症)的临床特点及诊疗方法。方法回顾分析1例磷酸甘油酸激酶1缺乏患儿临床资料,分析其临床特点及实验室检查结果,采用二代测序分析基因变异筛查结果。结果患儿男性,3岁11个月首次就诊。患儿每次均以抽搐起病,起病后病情迅速加重,出现反复抽搐发作,每次病程中均有溶血性贫血,第三次住院期间出现严重的横纹肌溶解症,且发病后有明显的智力、运动发育落后,基因检测显示患儿PGK 1基因错义变异(c.150C>G),该变异导致第50号氨基酸由Cys变为Trp,来自于母亲,其母为杂合子,符合X连锁隐性遗传方式,既往文献及数据库未见报道。根据ACMG指南,此变异判定为可能致病性(基因检测时,尚未出现横纹肌溶解症),后期结合临床表现及基因检测结果,确诊为PGK 1缺乏。结论磷酸甘油酸激酶缺乏症是一类罕见的X连锁隐性遗传病,由PGK 1基因变异所致,该变异未见报道,扩充了Ⅸ型糖原累积病基因变异数据库。

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。

拟南芥PGK基因家族功能的初步分析

磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)是一类进化上非常保守的蛋白家族,因而利用模式植物拟南芥研究PGK家族基因功能具有普遍意义。拟南芥基因组中含有三个PGK基因家族成员(PGK1,PGK2和PGK3),但是对于它们的基因表达模式和蛋白定位的研究还不是很清楚。本文利用实时荧光定量PCR技术检测了PGK基因家族的表达模式,结果表明三个PGK基因在拟南芥的各个组织器官和发育阶段中都有表达。利用拟南芥原生质体瞬时转化系统对三个PGK蛋白进行亚细胞定位,结果显示PGK1和PGK3定位于细胞基质,而PGK2定位于叶绿体。另外,我们分离得到了PGK2基因的T-DNA插入敲除突变体pgk2。pgk2在正常条件下表现出叶片黄化,PR1基因上调表达和H_2O_2过量积累等类似于超敏反应的细胞死亡表型。进一步的遗传分析表明pgk2的细胞死亡表型和T-DNA插入位点紧密连锁,暗示着pgk2的细胞死亡表型是由于PGK2的基因缺失造成的,因此PGK2可能在调控植物细胞程序化死亡过程中有重要作用。以上研究结果对于进一步探讨PGK基因家族的功能具有重要的参考价值。

PGK1基因沉默对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响

目的:观察PGK1基因沉默对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响。方法:常规体外培养SMMC7721肝癌细胞,Lipofectamine 3000方法将sh RNA-PGK1质粒及阴性载体转染至SMMC7721细胞;荧光实时定量PCR及Western Blot检测PGK1的表达,MTT检测细胞相对存活率。结果:与正常SMMC 7721细胞相比,在PGK1沉默的肝癌细胞中,PGK1基因的表达降低,细胞的相对存活率减少。结论:PGK1基因沉默能够抑制SMMC7721肝癌细胞的增殖。

牛乳腺炎无乳链球菌Pgk基因抗原优势区原核表达产物的抗原性分析

为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase,Pgk)基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因(AE009948)核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体Pgk-pET30a(+),再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2+亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。

干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后化学发光成像

目的研究用化学发光成像的方法观察脐带间充质干细胞转染CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒后的情况,代替活体成像仪的可行性。方法用CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒转染树鼩脐带间充质干细胞,用最适浓度的嘌呤霉素筛选,存活的细胞用6孔板的3个孔培养,贴壁后,3个孔依次加入底物D-荧光素钾盐,用化学发光成像仪拍照,再用软件进行活体成像转换。将转染成功的细胞注入麻醉后的树鼩皮下,树鼩静脉注射底物。结果细胞加入底物后有生物发光,发光强度随底物作用时间延长而减弱。树鼩皮下也观察到发光细胞。结论 CMV-Luciferase-PGK-Puro慢病毒能成功转染树鼩脐带间充质干细胞,转染成功的细胞用于动物模型治疗后,可进行活体成像,观察细胞在动物体内的分布。

子宫内膜癌组织中PGK1的表达及其与预后的关系

目的探讨子宫内膜癌组织中PGK1的表达情况及其对患者预后的影响。方法运用免疫组织化学SP法检测30例正常子宫内膜组织和130例子宫内膜癌组织中PGK1的表达,分析PGK1蛋白的表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系及对子宫内膜癌预后的影响。结果(1)30例正常子宫内膜组织标本中PGK1低表达27例(90%),高表达3例(10%),130例子宫内膜癌组织标本中,PGK1低表达72例(55.4%),高表达58例(44.6%),相对于正常子宫内膜组织,PGK1在子宫内膜癌组织中表达显著,有统计学差异(P<0.001);(2)PGK1的表达在子宫内膜癌不同FIGO分级(P<0.001),组织学分级(P=0.002),淋巴结转移状态(P<0.001)中差异显著;(3)生存曲线分析显示,PGK1高表达患者的生存时间少于低表达患者(P=0.002);(4)多因素分析提示,PGK1高表达不是子宫内膜癌患者预后的独立影响因素(P=0.077)。结论 PGK1高表达与子宫内膜癌的生长浸润行为相关,且与患者预后密切相关。通过检测PGK1的表达能够更加有效地评估子宫内膜癌患者的预后。

基于云台式PGK的反旋翼筒控制系统设计及仿真

为了实现对云台式PGK的反旋翼筒可以在惯性空间下保持静止,设计了一种新型的控制系统,系统对反旋翼筒控制采用相位环+速度环+电流环三闭环的控制方法,并基于Matlab/Simulink对反旋翼筒的三闭环控制方法进行了仿真验证。仿真结果表明:采用该控制方法,反旋翼筒动静态性能良好,稳定性高,响应速度快。验证了此控制方案的可靠性,为项目的进行一步推进打下良好的基础。

基于DSP的一体化PGK控制系统设计

弹载系统的一体化、模块化已成为趋势,据此提出利用DSP来实现精确制导组件(Precision Guidance Kit,PGK)一体化系统的控制,完成导弹的制导和控制任务,从而提高弹载系统的可靠性和导弹的作战能力;叙述了PGK控制系统中硬件与软件的设计过程,包括对控制模块、GPS接收机、地磁测量模块、无线装定模块等的设计和功能介绍,以及对软件工作流程和软件模块进行简要介绍;通过发射安装本PGK系统的修正弹进行飞行试验,GPS模块与地磁测量模块的测试结果表明该系统可以基本实现模块功能。

日本血吸虫pcDNA3.1(+)-SjPGK重组质粒的构建及鉴定

目的 构建日本血吸虫中国大陆株磷酸甘油酸激酶基因片段 (SjPGK )的真核表达重组质粒 ,寻找新的预防日本血吸虫病的候选疫苗分子。 方法 采用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术 ,从日本血吸虫总RNA中体外扩增SjPGK基因片段 ;克隆入pMD18-T载体中 ,然后挑取阳性克隆经双酶切分析、PCR鉴定 ;亚克隆入真核表达载体pcDNA3 .1(+ )中 ,阳性克隆经鉴定后进行脱氧核糖核酸序列测定 ;运用Blast程序 ,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。 结果 RT -PCR特异性扩增出一条长约 83 0bp大小的条带 ;重组质粒pMD18-T -SjPGK和 pcDNA3 .1(+ ) -SjPGK经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与RT -PCR产物一致的DNA片段 ;脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明 :SjPGK基因片段长为 83 0bp ,与SmPGK的核苷酸同源性为 85 % ,分值为 672 ;氨基酸同源性为 94% ,分值为 473。 结论 成功地构建 pcDNA3 .1(+ ) -SjPGK重组质粒 ,为构建其核酸疫苗提供了条件。

云台式PGK机构设计与仿真

为了解决PGK应用于低速旋转火箭弹,弹丸转速超出PGK翼筒的转速范围时,翼筒无法在惯性空间下保持不转而失去弹道修正能力,在保持原有尺寸和基本结构不变的条件下,设计新型云台式PGK,拓宽弹道修正所需的转速范围。根据PGK工作环境对其结构进行力学仿真,仿真计算结果表明,新型的云台式PGK可将适用的弹丸转速从原来的4.76~19.04 r/s改变为0~46 r/s。

布鲁氏菌磷酸甘油酸激酶(PGK)的毒性作用研究

探讨磷酸甘油酸激酶(PGK)对布鲁氏菌存活和引发细胞毒性的作用.将流产布鲁氏菌2308 pgk基因突变株(2308Δpgk)和互补株(2308Δpgk-C)置于不同环境压力中,检测突变株的存活能力.突变株和互补株感染小鼠巨噬细胞系(RAW264.7),检测突变株引起的细胞毒性.2308Δpgk突变株在不同应激条件下的存活率降低,并且对多粘菌素B和脱氧胆酸钠的敏感性增加,表明PGK的缺失降低了布鲁氏菌的应激状态.乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验显示,2308Δpgk引起的细胞毒性显著低于亲本株,表明PGK的突变影响了布鲁氏菌引发的细胞毒性.结果表明,布鲁氏菌感染过程中PGK参与了其存活和引发细胞毒性的作用.