猬草及其近缘属植物单拷贝核Pgk1基因序列的系统发育分析

文章对禾本科小麦族猬草属及其近缘属Thinopyrum(Eb)、Lophopyrum(Ee)、拟鹅观草属(St)、新麦草属(Ns)、大麦属(H)、赖草属(NsXm)和披碱草属(StH)植物共23个类群的单拷贝核Pgk1基因序列进行系统发育分析,探讨猬草属及其近缘属植物的系统发育关系。序列分析发现Pgk1基因序列在L.arenarius和Psa.juncea中有81bp的Stowaway家族DNA转座元件插入,而在Hy.duthiei、Hy.duthieissp.longearistata和L.akmolinensis中有29bp Copia家族的反转录转座元件插入。最大似然和贝叶斯推断进行的系统发育分析表明:(1)猬草属模式种Hy.patula与披碱草属、拟鹅观草属和大麦属具有密切的亲缘关系;(2)猬草属的其他物种Hy.duthiei、Hy.duthieissp.longearistata、Hy.coreana和Hy.komarovii与新麦草属和赖草属植物亲缘关系密切。研究结果支持将Hy.patula从猬草属组合到披碱草属中,而Hy.duthiei、Hy.duthieis sp.longearistata、Hy.coreana和Hy.komarovii应组合到赖草属中。

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。

酿酒酵母磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的分子克隆和特性研究

以大肠杆菌和酵母菌穿校质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600或HB101为受体构建成酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Hind Ⅲ基因文库。从基因文库中提取重组DNA转化酵母受体XSB44-35D(a,pgkl,leul,adel,trpl,gall),选出转化体Pgk1^+。琼脂糖凝胶电泳指出所插入的DNA片段长度为3.1kb。 PGK1 DNA片段插入的方向性是此基因的5'-侧翼区靠近pCN60的BamH Ⅰ位点,而3'-侧翼区接近Bgl Ⅱ位点。Cla Ⅰ,EcoRV,Kpn Ⅰ,Xba Ⅰ,Pst Ⅰ,Hind Ⅲ,BamH Ⅰ及Pvu Ⅰ等核酸内切酶制作的酶切图谱的结果表明,除报道的PGK酶切位点外,还发现一个新的Kpn Ⅰ及一个新的Cla Ⅰ位点。

有效PGK1短发夹RNA序列的筛选

目的筛选有效抑制磷酸甘油酸激酶1(PGK1)基因的短发夹核糖核酸(shRNA)序列。方法针对PGK1的不同基因区域设计4个shRNA序列,应用LipofectamineTM2000方法转染至胶质瘤细胞株U251细胞,荧光显微镜下观察shRNA的转染效率。采用RT-PCR方法检测PGK1的mRNA表达,Western blot方法检测PGK1的蛋白表达。结果针对PGK1-homo-441位点的shRNA4(5′-GCAAGGATGTTCTGTTCTTGA-3′)能更有效地抑制PGK1的mRNA及蛋白表达。结论shRNA4是能有效抑制PGK1表达的序列,可用于PGK1的功能研究。