PHLPP2对小鼠Burkitt淋巴瘤移植瘤的影响

目的 研究PH结构域富含亮氨酸重复序列的蛋白磷酸酶2(PH domain leucine-rich repeat-containing protein phosphatase 2,PHLPP2)基因过表达对伯基特淋巴瘤(Burkitt lymohima,BL)移植瘤的影响及其对蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路相关蛋白表达的影响。方法 在BL细胞系(CA46)中构建PHLPP2稳定过表达模型,并接种于重度免疫缺陷(NOD/ShiltJGpt-Prkdcem26Cd52112rgem26Cd22/Gpt,NCG)小鼠构建异种移植瘤模型。观察小鼠成瘤情况,测量肿瘤大小,绘制瘤体生长曲线,实验终点对比两组小鼠肿瘤大小及质量,评估PHLPP2对肿瘤生长的抑制效果。免疫组织化学染色检测PHLPP2、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)蛋白表达情况,Western blot法检测PHLPP2、AKT、核糖体蛋白S6激酶β1 (ribosomal protein S6 kinase beta-1,S6K1)蛋白表达水平及AKT、S6K1蛋白磷酸化水平。结果 成功构建NCG小鼠BL动物模型:10只小鼠皮下均有肿瘤形成,成瘤率100%。PHLPP2基因对小鼠移植瘤的影响:对照组与实验组小鼠皮下移植瘤成瘤时间分别为(10.60±1.95)、(15.00±1.58)d;与对照组(2.00±1.01) mm3相比,实验组(0.63±0.18)mm3肿瘤体积明显减少;对照组肿瘤质量为(0.83±0.33)g,实验组为(0.31±0.03)g,差异均有统计学意义(P均<0.05)。Western blot及免疫组化结果:Western blot检测到实验组PHLPP2表达水平高于对照组,实验组p-AKT表达水平低于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05);免疫组化结果显示,实验组及对照组中PHLPP2蛋白及p-AKT蛋白在细胞膜、细胞质中表达,其中实验组PHLPP2蛋白呈强阳性,p-AKT蛋白呈弱阳性,对照组PHLPP2蛋白呈弱阳性,p-AKT呈强阳性,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PHLPP2在BL发生发展过程中发挥着重要的抑制作用,其抑制作用可能通过抑制AKT信号通路相关下游蛋白的磷酸化水平而实现。

FKBP51·PHLPP·Akt信号模块对大鼠脑缺血／再灌注后Akt磷酸化及海马神经元损伤的影响

目的探讨FKBP51·PHLPP·Akt信号模块对大鼠脑缺血／再灌注（I／R）后Akt磷酸化及海马CAl区迟发性神经元损伤的影响。方法采用Pulsinelli-Brierley法制作全脑缺血损伤模型，每亚组6只动物，缺血前连续3d侧脑室注射PH结构域且富含亮氨酸重复基序的丝／苏氨酸蛋白磷酸酶2（PHdo．mainand Leucinerichrepeat Protein Phosphatases，PHLPP2）反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）后缺血15rain，再灌注6h，应用免疫共沉淀及免疫印记分别检测PHLPP2、FK506连接蛋白5（FK506bindingprotein5，FKBP51）和蛋白激酶B（ProteinkinaseB，Akt）三者两两结合、检测Akt及其磷酸化的表达情况。再灌注5d，断头取脑，石蜡切片，苏木精一伊红染色，图像分析测定单位面积内染色细胞面积总和。I／R＋ASODN组分别与I／R组及I／R＋错义寡核苷酸（missense0ligodeoxynucleotides，MSODN）组比较，进行统计学分析。结果单因素方差分析结果显示：与I／R＋PHLPP2MSODN组（1．24＋0．24）比较，I／R＋PHLPP2ASODN组（1．06±0．01）PHLPP2与Akt间的两两结合水平明显受到抑制（P〈0．05）；与I／R＋PHLPP2MSODN组（1．68±0．11）比较，I／R＋PHLPP2ASODN组（1．04±0．13）FKBP51与Akt间的两两结合水平明显受到抑制（P〈0．05）；与I／R＋PHLPP2MSODN组（0．58±0．01）比较，I／R＋PHLPP2ASODN组（0．76±0．02），P-Akt表达水平明显增加（P〈0．05），而Akt总蛋白表达无明显变化（P〉0．05）；I／R5d＋PHLPP2ASODN组[（88-3±2．7）个]与I／R＋PHLPP2MSODN组[（20．1±2．5）个]比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论FKBP51·PHLPP·Akt模块可能通过Akt信号通路参与脑缺血再灌注损伤，促进海马CAl区神经元的迟发性损伤。

miR-452靶向PHLPP1抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨微小核糖核酸(micro RNA,miR)-452靶向PH结构域富含亮氨酸重复序列的蛋白磷酸酶1(PHLPP1)抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭的作用。方法选取142例结直肠癌组织及癌旁组织。体外培养结直肠癌细胞株SW480细胞(SW480癌细胞组),并以miR-452模拟物(miR-452模拟物组)、miR-452抑制剂(miR-452抑制剂组)转染SW480细胞。噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞活力、癌细胞单克隆形成数目。流式细胞术检测凋亡率及细胞周期,Transwell细胞迁移实验检测穿膜细胞数,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-452-5、PHLPP1 mRNA表达水平,酶联免疫吸附法测定培养液中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、血管内皮生长因子(VEGF)在培养液中水平。结果结直肠癌组miR-452-5p相对表达水平(1.25±0.65)低于癌旁组(3.76±0.43,t=17.04,P<0.01)。依miR-452模拟物组→SW480癌细胞组→miR-452 inhibitor组之序,癌细胞单克隆形成数目、穿膜数(P<0.01)升高,细胞凋亡率、G1期比例降低(P<0.01);miR-452-5p、PHLPP1 mRNA表达水平降低(P<0.01),MMP-9、Cyclin D1、VEGF蛋白表达水平升高(P<0.01)。miR-452与PHLPP1表达水平呈明显正相关(P<0.01),与MMP-9、Cyclin D1、VEGF表达水平分别呈负相关(P<0.01)。结论 miR-452通过靶向降低PHLPP1的表达而抑制结直肠癌细胞增殖、迁移浸润,其机制与miR-452诱导结直肠癌细胞低表达MMP-9、Cyclin D1、VEGF有关。

miR-25-3p和PHLPP2在肺腺癌中的表达及其与预后的相关性分析

目的检测miR-25-3p与PH结构域和富含亮氨酸的重复蛋白磷酸酶2(PHLPP2)在肺腺癌组织中的表达情况,探讨二者与肺腺癌临床病理参数及预后的相关性。方法选择2014年3月至2016年11月在该院手术治疗的肺腺癌患者90例,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测研究对象肺腺癌组织与癌旁组织中miR-25-3p和PHLPP2 mRNA表达水平,分析miR-25-3p mRNA和PHLPP2表达与肺腺癌患者预后的关系。结果miR-25-3p mRNA在肺腺癌组织中表达水平高于癌旁组织(P<0.05),PHLPP2 mRNA在肺腺癌组织中表达水平低于癌旁组织(P<0.05);miR-25-3p mRNA和PHLPP2表达水平与肺腺癌分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05);miR-25-3p mRNA高表达组患者的3年累积生存率明显低于miR-25-3p mRNA低表达组,PHLPP2高表达组患者的3年累积生存率明显高于PHLPP2低表达组(P<0.05)。Cox回归模型分析显示,淋巴结转移、miR-25-3p mRNA高表达、PHLPP2低表达是影响肺腺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论在肺腺癌组织中miR-25-3p mRNA高表达、PHLPP2低表达与患者生存情况有关,可能作为肺腺癌患者潜在的预后标志物。

微小RNA-224对乳腺癌锁骨上淋巴结转移的影响及其作用机制

目的探讨微小RNA(miR)-224对乳腺癌锁骨上淋巴结转移的影响及其作用机制。方法选择2018年6月至2019年6月南阳市中心医院收治的45例锁骨上淋巴结转移的乳腺癌和45例无淋巴结转移的乳腺癌作为研究对象。采用转录组织化学方法分析淋巴结转移和无淋巴结转移癌组织中差异表达的miRNA。采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析差异表达的miRNA(miR-224);采用慢病毒介导miRNA阴性对照和miR-224过表达在人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)乳腺癌细胞建立对照细胞系(对照组)和miR-224过表达细胞系(miR-224组)。将对照组和miR-224组细胞接种至裸鼠腋下,并于30 d后处死,解剖分析锁骨上淋巴结转移;生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-224靶基因,蛋白质印迹法(Western blot)分析临床样本和细胞系miRNA靶蛋白(PHLPP)1表达水平,组间比较采用t检验。结果转录组化学结果显示,淋巴结转移乳腺癌组织miR-224表达水平(5.08±0.69)明显高于未淋巴结转移乳腺癌组织(2.10±0.69),差异有统计学意义(t=3.109,P<0.05)。荧光定量PCR结果验证显示,淋巴结转移乳腺癌组织miR-224表达水平(2.98±0.41)高于无淋巴结转移乳腺癌组织miR-224表达水平(1.20±0.31),差异有统计学意义(t=2.839,P<0.05)。miR-224组细胞侵袭数量[(119.49±9.72)个]高于对照组细胞侵袭数量[(69.39±6.09)个],差异有统计学意义(t=4.091,P<0.05)。miR-224组细胞接种移植瘤30 d后淋巴结转移病灶数[(25.98±3.12)个]高于对照组细胞接种移植瘤30 d后淋巴结转移病灶数[(10.54±2.39)个],差异有统计学意义(t=3.001,P<0.05)。PHLPP1是miR-224靶基因。淋巴结转移乳腺癌组织中PHLPP1蛋白表达水平(0.36±0.12)低于未淋巴结转移乳腺癌组织中PHLPP1蛋白表达水平(0.94±0.16),差异有统计学意义(t=2.816,P<0.05)。miR-224组细胞PHLPP1蛋白表达水平(0.50±0.12)低于对照组细胞PHLPP1蛋白表达水平(1.04±0.18),差异有统计学意义(t=2.212,P<0.05)。结论miR-224在淋巴结转移的乳腺癌中呈高表达,其可能机制为通过调节PHLPP1蛋白表达参与了乳腺癌的侵袭和转移。