中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl PHA)在嗜水气单胞菌I型PHA合酶缺失突变株中的合成(英文)

拥有Ⅰ型聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶基因的嗜水气单胞菌CGMCC0911株可利用月桂酸而不能利用葡萄糖作为碳源积累PHBHHx。将氯霉素抗性基因(Cm)插入到该基因中,获得带有I型PHA合酶断裂基因(phaC::Cm)的自杀质粒pFH10。自杀质粒pFH10通过接合作用转入嗜水气单胞菌CGMCC0911株中并发生体内同源重组,Cm被整合到基因组上,获得Ⅰ型PHA合酶缺失突变株。DNA序列测定证明了这一结果。GC分析表明,突变株不再产生PHBHHx,但却可利用月桂酸或葡萄糖积累中长链PHA,明显表明野生型嗜水气单胞菌基因组中存在另一个编码Ⅱ型PHA合酶的基因,且只有Ⅰ型PHA合酶被钝化后,这个功能被隐藏的Ⅱ型PHA合酶才可在细胞中发挥作用。

SOE-PCR法构建新型PHA嵌合酶研究

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate,PHA)合酶是PHA合成过程中的关键酶,其活性和底物特异性决定PHA含量和单体组成.构建嵌合酶是改变PHA单体组成的一种有效方式.利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)法,以富氧产碱菌和嗜水气单胞菌PHA合酶基因为亲本构建新的PHA嵌合酶.结果表明,带有新型嵌合酶基因的重组菌株AHRE可利用葡萄糖酸钠和果糖产生3HB.利用辛酸钠、月桂酸、油酸、辛酸钠和葡萄糖酸钠混合碳源,除3HB和3HHx外,还产生了新的单体组分3HO.辛酸钠和葡萄糖酸钠混合碳源发酵,PHA含量最高,达57.54%.辛酸钠为单一碳源时,3HO单体组成含量最高,占PHA总量1.932%,证明嵌合酶构建成功.这为今后利用基因工程技术改变菌株PHA单体组成提供了有效方法,为获得具有更好材料学特性的PHA奠定了工作基础.

来源于马赛菌(Massilia sp.)UMI-21的ACS_(MU)和PhaC_(MU)体外表达及功能研究

【目的】构建马赛菌(Massilia sp.)UMI-21来源乙酰辅酶A合成酶ACS_(MU)和聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)合酶PhaC_(MU)的体外重组表达体系并过表达2种酶,利用体外合成体系确定2种酶在Massilia sp.UMI21聚3-羟基丁酸(polyhydroxybutyrate,PHB)合成途径中的主要功能。【方法】利用无缝克隆技术将来源于Massilia sp.UMI-21的乙酰辅酶A合成酶基因acsMU和PHA合酶基因phaC_(MU)扩增后与pQE-80L质粒连接,转导大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)构建2个基因的重组表达体系;利用6×His标签纯化蛋白ACS_(MU)和PhaC_(MU),并采用5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB]法测定其活性;使用体外单相合成系统(one-phase reaction system,OPRS),以(R)-3HB为底物,验证ACS_(MU)和PhaC_(MU)这2种酶在合成PHB途径中的功能。【结果】成功构建了ACS_(MU)和PhaC_(MU)蛋白重组表达菌株BL21-pQE-80L-acsMU和BL21-pQE-80L-phaC_(MU),提纯得到过表达蛋白ACS_(MU)和PhaC_(MU)产率分别为24.8 mg/L和25.6 mg/L;ACS_(MU)酶比活力为(0.148±0.011)U/mg。PhaC_(MU)酶对(R)-3HBCoA的比活力为(0.102±0.011)U/mg;核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy,^(1)H-NMR)分析结果表明,使用ACSPt-PCT_(CP)-PhaC_(Re)、ACS_(MU)-PCT_(CP)-PhaC_(Re)和ACS_(MU)-PCT_(CP)-PhaC_(MU)这3条OPRS途径均能合成PHB,产量分别为0.62、0.76和0.64 g/L。【结论】acsMU和phaC_(MU)基因可利用大肠杆菌表达体系过表达并可获得具有活性的可溶性蛋白;对比ACSPt-PCT_(CP)-PhaC_(Re)合成体系,ACS_(MU)替代ACSPt合成PHB产量增加22.58%,在聚合酶相同的情况下,PHB的合成产量依赖乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)合成乙酰辅酶A的稳定性。使用PhaC_(MU)代替PhaC_(Re),对比ACS_(MU)-PCT_(CP)-PhaC_(Re)组合,合成PHB产量减少了15.79%。在聚合前体浓度相同的情况下,PHB合成量依赖聚合酶的活性。

地中海富盐菌PhaE蛋白乙酰化修饰对其功能的影响

【目的】研究地中海富盐菌PHA合酶(Pha EC)中Pha E亚基乙酰化修饰对其功能的影响,探讨乙酰化修饰对菌体生理代谢的调控作用。【方法】蔗糖密度梯度离心收集PHA颗粒,质谱鉴定颗粒结合蛋白Pha E的乙酰化位点。将乙酰化位点(赖氨酸,K)分别突变为精氨酸(R)(模拟去乙酰化)或谷氨酰胺(Q)(模拟乙酰化),利用同源双交换原理,将突变后的基因原位敲入基因组。以野生型为对照,检测突变对菌体生长、葡萄糖消耗和PHA合成能力的影响。利用Western blot检测PHA颗粒上Pha E的含量,进一步分析乙酰化修饰对蛋白功能的影响。【结果】在Pha E蛋白105位和170位赖氨酸(K)2个位点检测到乙酰化修饰。利用遗传操作系统将突变的基因原位敲入,共得到6种突变株。发酵结果表明,任何一种单突变对菌体生长及PHA合成的影响均不明显。但当2个位点同时突变成精氨酸(K105R/K170R)时,突变株生长及合成PHA的能力均受到明显抑制,2个位点同时突变成谷氨酰胺(K105Q/K170Q)则无明显影响。进一步的Western blot结果表明,突变成精氨酸的双突变株的PHA颗粒上,Pha E蛋白的含量相较于野生型约降低了一半。【结论】Pha E蛋白的去乙酰化能够导致菌株利用葡萄糖合成PHA的能力显著降低,其可能原因是降低了Pha E与PHA颗粒或PHA颗粒上Pha C的结合能力,从而降低了Pha EC合酶的活性。