水稻PHD锌指蛋白cDNA的克隆及其表达分析

利用cDNA-AFLP分析籼稻明恢86应答稻纵卷叶螟取食基因差异表达,发现1个与植物同源结构域(PHD)锌指蛋白高度同源的TDF,分离获得该TDF对应的粳稻全长cDNA.该全长cDNA与籼稻、玉米、蓖麻、葡萄、拟南芥和大豆等作物PHD锌指蛋白推定氨基酸序列的同源性分别为98.43%、86.01%、54.58%、57.02%、57.51%和55.88%.荧光定量PCR研究表明,日本晴(粳稻)叶片中该基因的表达也受稻纵卷叶螟取食的诱导,推测该基因与籼稻和粳稻应答稻纵卷叶螟取食密切相关.

PHD锌指蛋白14敲除促进小鼠急性损伤后肾纤维化发生

目的考察肾组织PHD锌指蛋白14(PHF14)的表达变化,探讨PHF14在急性损伤后肾纤维化中的作用。方法选用IVC级C57BL/6小鼠20只,随机分为2组:对照组(n=5)和叶酸刺激实验组(n=15),实验组又分为叶酸作用后2、14和28d3个亚组,每个亚组5只小鼠。实验组单次给予叶酸腹腔注射(250mg/kg,溶媒为0.3mol/L碳酸氢钠溶液),对照组单次给予溶媒腹腔注射。每组小鼠在预定的时间点处死,留取血清检测肌酐(SCr)和尿素氮(BUN);留取肾组织,行Masson染色验证模型,蛋白质免疫印迹法研究PHF14在急性肾损伤纤维化进程中的表达变化。利用PHF14基因敲除鼠,制作与上述相同的急性肾损伤模型,比较PHF14敲除组和未敲除组肾脏在第2、14和28天的病理变化,并行α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和collagen 1免疫组织化学染色,蛋白质免疫印迹法检测转化生长因子β(TGF-β)、α-SMA、collagen 1的表达规律。结果与对照组相比,实验组各时间点小鼠SCr与BUN变化曲线提示急性肾损伤病程;肾脏病理变化显示,随叶酸作用时间的增加,肾脏逐渐进展到纤维化,提示模型制作成功。在急性肾损伤至慢性纤维化过程中,PHF14持续高表达。与野生型小鼠相比,PHF14敲除小鼠TGF-β、α-SMA、collagen 1表达较高,肾纤维化程度更重。结论叶酸腹腔注射可成功建立急性肾损伤及损伤后肾小管间质纤维化模型,PHF14的表达在叶酸促纤维化刺激后持续上调,而PHF14敲除会加重急性损伤后肾纤维化的发生,提示PHF14对肾脏纤维化进程起抑制作用,可能是内源性肾纤维化保护因子。

组蛋白去甲基化酶PHD锌指蛋白8与神经发育

PHD锌指蛋白8(PHF8)是一种Fe2+和α-酮戊二酸依赖的组蛋白赖氨酸去甲基化酶.PHF8属于包含JmjC结构域蛋白家族,在N端还含有一个PHD(planthomeodomain)锌指结构域.人的PHF8基因突变往往破坏组蛋白去甲基化酶活性,从而引发遗传性X-连锁智力迟滞(XLMR)并伴发唇裂的发生.PHF8一方面可催化H3K9me2/1、H4K20me1和H3K27me2的去甲基化,另一方面还通过N端PHD锌指结构域与H3K4me3结合而发挥转录共激活作用.PHF8可调节rRNA和多个涉及神经发育的蛋白质编码基因如JARID1C的表达.这些研究显示,PHF8是一种重要的神经发育调节因子,从而拓宽了对组蛋白甲基化与基因表达关联的理解,同时为XLMR疾病的理解提供了新的线索.

非小细胞肺癌中PHF23,ACTN4表达与预后的相关性分析

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)中PHD锌指蛋白23(PHF23),α-辅肌动蛋白(ACTN4)的表达及预后的相关性。方法选取2017年2月至2020年11月期间我院收治的82例NSCLC患者。采用实时荧光定量PCR和免疫组化检测NSCLC组织及癌旁组织PHF23,ACTN4表达。相关性分析采用Spearman秩相关和Pearson相关分析。Kaplan-Meier曲线分析PHF23,ACTN4表达与患者预后的关系。Cox回归分析患者预后影响因素。结果NSCLC癌组织中PHF23,ACTN4表达阳性率分别为73.17%(60/82),75.61%(62/82),高于癌旁组织7.32%(6/82),6.10%(5/82),差异具有统计学意义(χ^(2)=73.937,81.987,均P<0.001)。NSCLC癌组织中PHF23与ACTN4表达呈正相关(r=0.745,P<0.001)。NSCLC癌组织中PHF23 mRNA,ACTN4 mRNA表达及侵袭转移指标N-钙黏素mRNA,波形蛋白mRNA高于癌旁组织,差异具有统计学意义(均P<0.05)。NSCLC癌组织中PHF23 mRNA与N-钙黏素mRNA,波形蛋白mRNA呈正相关(r=0.671,0.721,均P<0.001)。ACTN4 mRNA与N-钙黏素mRNA,波形蛋白mRNA呈正相关(r=0.663,0.708,均P<0.001)。肿瘤分期ⅢA期、淋巴结转移、在NSCLC癌组织中PHF23,ACTN4阳性率明显高于Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移的癌组织(P<0.05)。PHF23阳性组,ACTN4阳性组的NSCLC患者3年无进展生存率为25.00%(15/60),25.81%(16/62),分别低于PHF23阴性组,ACTN4阴性组81.82%(18/22),85.00%(17/20),差异具有统计学意义(Log Rankχ^(2)=17.810,26.380,均P<0.001)。TNM分期ⅢA期、淋巴结转移、PHF23阳性、ACTN4阳性是影响NSCLC患者预后的危险因素。结论NSCLC中PHF23,ACTN4表达上调,与TNM分期、淋巴结转移相关,是影响患者预后的独立危险因素。

Circ-CDYL通过miR-223-3p/PHF19轴调节多发性骨髓瘤对硼替佐米的敏感性

目的 探讨环状RNA Circ-CDYL调节多发性骨髓瘤(MM)对硼替佐米(BTZ)的敏感性,以及对miR-223-3p/PHD锌指蛋白19(PHF19)轴的影响。方法 收集盐城市第三人民医院118例MM患者血清标本,其中60例患者未接受任何化疗(BTZ敏感组),58例患者接受BTZ治疗并产生化疗耐药性(BTZ耐药组),比较两组Circ-CDYL及miR-223-3p、PHF19的表达情况。将MM1.R细胞根据细胞转染情况分为C组、sh-Circ-C组、sh-Circ-CDYL组、sh-Circ-CDYL+anti-miR-223-3p组和sh-Circ-CDYL+pcDNA-PHF19组,对5组细胞进行相应转染。采用荧光定量PCR(RT-qPCR)测定Circ-CDYL、miR-223-3p和PHF19 mRNA水平,CCK-8法测定MM1.R细胞活性。采用克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况,采用免疫印迹法(Western blotting)检测凋亡蛋白[增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67、剪切化半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶3(C-caspase 3)]及PHF19蛋白的表达水平,采用双荧光素酶报告基因实验检测Circ-CDYL与miR-223-3p/PHF19的靶向关系。结果 Circ-CDYL和PHF19在BTZ耐药组患者血清标本和MM1.R细胞中均呈高表达(P<0.05),miR-223-3p呈低表达(P<0.05)。下调Circ-CDYL表达下调Circ-CDYL表达可明显降低MM1.R细胞对BTZ的半数抑制浓度(IC_(50)),抑制增殖活力,使凋亡蛋白PCNA、Ki67表达水平均下调,细胞凋亡率、C-caspase 3蛋白表达水平上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。抑制miR-223-3p或过表达PHF19可部分逆转敲低Circ-CDYL后的MM1.R细胞对BTZ敏感性(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-223-3p可抑制Circ-CDYL、PHF19的表达,Circ-CDYL、PHF19是miR-223-3p的靶基因。结论 敲低Circ-CDYL可通过miR-223-3p/PHF19轴而提高MM1.R细胞对BTZ的敏感性。

敲低RBX1通过下调PHF5A抑制胰腺癌细胞增殖,迁移和侵袭并促进凋亡

目的:研究环盒蛋白1(ring-finger protein 1,RBX1)对胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用及其潜在的作用机制。方法:利用基因表达谱交互式分析网站(gene expression profile interactive analysis web⁃site,GEPIA),实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)、Western blot检测RBX1在PAAD组织、细胞中的表达和预后价值。使用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、细胞克隆形成能力实验、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)、细胞划痕实验、Transwell实验检测RBX1敲低对胰腺癌-1(pancreatic carcinoma-1,PANC-1)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。通过LinkedOmics网站研究PAAD中RBX1和PHD锌指结构域蛋白5A(plant homodomain finger-like domaincontaining protein 5A,PHF5A)的相关性。qRT-PCR和Western blot检测RBX1敲低后PHF5A的表达,进行功能拯救实验。结果:RBX1在PAAD组织和细胞系中高表达,与不良预后相关(P<0.05)。RBX1敲低抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.05)。RBX1和PHF5A在PAAD中具有相关性(r=0.692),且RBX1正向调控PHF5A表达(P<0.05)。功能拯救实验表明PHF5A过表达部分逆转了RBX1敲低对PANC-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用(P<0.05)。结论:RBX1敲低通过下调PHF5A表达抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭,促进凋亡。

PHF8基因对食管鳞状细胞癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的利用慢病毒(lentivirus)介导的短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)建立人食管鳞状细胞癌(esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC,以下简称食管鳞癌)裸鼠移植瘤模型,观察锌指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8,PHF8)对移植瘤生长的影响。方法分别将未感染慢病毒(空白对照组)、感染Nonsilencing-shRNA慢病毒(阴性对照shRNA组)和PHF8shRNA慢病毒(PHF8 shRNA组)的人食管鳞癌细胞系TE-1接种于裸鼠背部皮下,建立食管鳞癌裸鼠移植瘤模型。定期测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。4周后处死裸鼠,定量PCR及Western blotting法检测肿瘤组织中PHF8的表达。结果 PHF8shRNA组较阴性对照shRNA组、空白对照组的裸鼠致瘤能力明显减弱,PHF8 mRNA和蛋白的表达水平显著降低。结论慢病毒介导的shRNA干扰能有效减少食管鳞癌裸鼠移植瘤中PHF8的表达,而降低PHF8的表达能抑制食管鳞癌移植瘤的生长。

沉默PHF8重组慢病毒的制备及其对食管鳞癌细胞增生的影响

目的制备锌指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8,PHF8)RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组慢病毒(lentivirus)颗粒,建立PHF8表达沉默的人食管鳞癌(esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC)稳定细胞系并观察PHF8对细胞增生的影响。方法将目的基因或阴性对照短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体与包装载体共转染病毒包装细胞293T,收集并浓缩上清液获得重组慢病毒;测定病毒滴度后用于感染食管鳞癌细胞;通过荧光显微镜及流式细胞仪观察感染效率,嘌呤霉素筛选法建立稳定细胞系;定量PCR及Western Blotting检测PHF8的表达沉默;MTS法检测细胞的增生特性。结果成功制备了沉默PHF8的重组慢病毒;应用重组病毒感染食管鳞癌细胞后,PHF8 mRNA和蛋白的表达水平显著降低,细胞的增生明显下降。结论慢病毒介导的shRNA干扰能有效抑制食管鳞癌细胞的PHF8表达及细胞增生。